華重樓離體胚培養(yǎng)及植株再生初探

陳瑤 周寒梅 何兵 李維

摘 要： 為探明華重樓離體胚培養(yǎng)及植株再生的基本體系，該文以華重樓離體幼胚為試驗(yàn)材料，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，研究不同光照、不同濃度梯度組合的植物生長調(diào)節(jié)劑對華重樓離體幼胚萌發(fā)、成苗的影響。結(jié)果表明：培養(yǎng)到60 d時(shí)，暗培養(yǎng)條件下華重樓離體幼胚的生長率和萌發(fā)率分別比光培養(yǎng)條件下高45.25%、19.17%，故暗培養(yǎng)比光培養(yǎng)更有利于華重樓離體幼胚生長發(fā)育。當(dāng)GA3濃度相同時(shí)，離體幼胚萌發(fā)所需時(shí)間隨IAA濃度增加而延長。不同濃度的GA3都可促進(jìn)離體幼胚萌發(fā)，促進(jìn)作用由強(qiáng)到弱依次為5 mg·L-1 GA3>1 mg·L-1 GA3> 10 mg·L-1 GA3。在黑暗條件下，優(yōu)選得到最適華重樓離體幼胚生長發(fā)育配方為1/2 MS+30 g·L-1 蔗糖+7 g·L-1瓊脂+0.5 g·L-1 活性炭+5 mg·L-1GA3+1 mg·L-1 IAA。此配方可誘導(dǎo)華重樓離體幼胚在2個(gè)月左右萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)50%需80 d左右。在華重樓成熟胚出苗培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，高濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑會抑制華重樓成熟胚生長發(fā)育，高濃度GA3甚至?xí)?dǎo)致華重樓成熟胚死亡。優(yōu)選得到最適華重樓成熟胚出苗配方為MS+30 g·L-1 蔗糖+6.2 mg·L-1 硼酸+7 g·L-1 瓊脂+0.7 g·L-1 活性炭+0.5 mg·L-1 2，4-D+1.5 mg·L-1 IAA + 1.5 mg·L-1 ZT+5mg·L-1 GA3，誘導(dǎo)成熟胚出苗需43 d左右，75 d左右可形成真葉。

關(guān)鍵詞： 胚培養(yǎng)， 離體幼胚， 成熟胚， 光照， 植物生長調(diào)節(jié)劑

中圖分類號： Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）11-1681-10

Abstract： Light and plant-growth regulators have a great influence on the regeneration efficiency of somatic embryos and the growth of regenerated plants. In this study， the effects of light and plant-growth regulators on the regeneration of in vitro embryos and the growth of regenerated plants were examined in immature in vitro embryos from Paris polyphylla var. chinensis seeds. The main purpose was to explore the basic system of in vitro embryos culture and growth of regenerated plants in P. polyphylla var. chinensis. In order to study the effects of plant-growth regulators on the growth and development of immature in vitro embryos and the growth of regenerated plants， supplemented with plant-growth regulators with different kinds and concentrations to MS mediums. In order to study the effect of light on the growth and development of immature in vitro embryos of P. polyphylla var. chinensis， the immature in vitro embryos were cultured in light and dark conditions. The results showed that dark conditions were more conducive to the growth and development of immature in vitro embryos in P. polyphylla var. chinensis than light conditions. When cultured for 60 d， the growth rate and germination rate of immature in vitro embryos of P. polyphylla var. chinensis under dark culture conditions were 45.25%， 19.17% higher than those under light culture conditions， respectively. When the concentration of GA3 was the same， the germination time of immature in vitro embryos was prolonged as the concentration of IAA increased. Different concentrations of GA3 promoted the germination of immature in vitro embryos. The promoting effect was 5 mg·L-1? GA3>1 mg·L-1? GA3> 10 mg·L-1? GA3. Under dark conditions， the best formula for immature in vitro embryos of P. polyphylla var. chinensis germination was 1/2 MS + 30 g·L-1 sucrose + 7 g·L-1 agar + 0.5 g·L-1 activated carbon + 5 mg·L-1 GA3+ 1 mg·L-1 IAA. This induced in vitro embryo P. polyphylla var. chinensis germination in about two months. The germination rate reached 50% after about 80 d. In the mature embryos emergence experiment， a high concentration of plant-growth regulators inhibited the growth and development of mature embryos in P. polyphylla var. chinensis. A high concentration of GA3 in particular led to the death of mature embryos. The best formula for seedlings of mature embryos was MS + 30 g·L-1 sucrose + 6.2 mg·L-1 boric acid + 7 g·L-1 agar + 0.7 g·L-1 activated carbon + 0.5 mg·L-1 2，4-D + 1.5 mg·L-1 IAA + 1.5 mg·L-1? ZT + 5 mg·L-1? GA3. Mature embryos could produce seedlings within only 43 d. True leaves were formed after around 75 days.

Key words： embryos culture， immature in vitro embryos， mature embryos， light， plant-growth regulator

華重樓（Paris polyphylla var. chinensis）是我國Ⅱ級保護(hù)植物、名貴中藥材。重樓中主要活性物質(zhì)為甾體皂苷，具有抗腫瘤（Huang et al.， 2007;Wu et al.， 2013）、抗菌（Qin et al.， 2012）、抗氧化（張寧，2016）、止血（李洪梅等，2017）等作用。干燥重樓根莖是云南白藥、季德勝蛇藥片、宮血寧等65種中成藥的重要原料（武珊珊等，2004;楊天梅等，2017;張翔宇等，2017）。由于重樓藥用功效不斷被開發(fā)，市場價(jià)格不斷攀升，導(dǎo)致重樓野生資源遭到無規(guī)律、大量的采挖，野生資源急劇減少。20世紀(jì)80年代，干燥重樓根莖價(jià)格約每千克2.5元（何良艷等，2011），近年來已上漲到每千克400元（趙庭周等，2014）。在巨大經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，重樓野生資源陷入“越挖越少、越少越貴、越貴越挖”的惡性循環(huán)。我國80%的野生重樓已被開發(fā)利用（黃希等，2016）。為緩解重樓野生資源困境，必須加快重樓人工繁殖速度。但如何打破重樓種胚形態(tài)休眠和生理休眠、提高種子萌發(fā)率等方面仍沒有取得突破性進(jìn)展。因此，研究重樓屬植物組織培養(yǎng)技術(shù)是解決重樓屬植物快繁瓶頸的有效途徑。不同學(xué)者分別以重樓根狀莖（熊海浪等，2012;宋發(fā)軍等，2013;王躍華等，2014;劉銀花等，2015b）、莖尖、子房、莖段（李群等，2006）、芽（楊麗云等，2008;王躍華等，2014）、芽軸（劉銀花等，2015a）、葉片（熊海浪等，2012;王躍華等，2014）、種胚（熊海浪等，2012;王躍華等，2015）、種子（宋發(fā)軍等，2013;楊淋等，2013）等為材料建立了重樓組織培養(yǎng)體系，但都存在愈傷組織誘導(dǎo)和增殖率低、幼苗移栽成活率低等問題，實(shí)用價(jià)值不高。

胚培養(yǎng)是在離體無菌條件和適宜培養(yǎng)基中使離體胚發(fā)育成苗的技術(shù)（王蒂，2004），且對促進(jìn)植物育種和遺傳學(xué)研究具有重要意義（Yao et al.， 2016;Liu et al.， 2016）。進(jìn)行胚培養(yǎng)的主要目的之一是打破種子休眠加速萌發(fā)，縮短育種周期（王雪玲，2014）。胚培養(yǎng)受很多條件的影響，如胚的品種、胚齡、培養(yǎng)基種類、激素種類和濃度、碳水化合物種類和濃度、光照、溫度、pH值等（田玲，2007; 雷秀娟，2013）。胚培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)在浙貝母（蘇新，1995）、人參（雷秀娟，2013）、伊貝母（李麗，2017）、橄欖（Germana et al.， 2014）等藥用植物研究中取得成功。目前未見有關(guān)華重樓種子離體胚培養(yǎng)的報(bào)道。

重樓屬（Paris）植物結(jié)籽量大，種子數(shù)量多，是繁殖的好材料。但由于其植物本身特殊的生物學(xué)特性，種子在自然條件下，需要兩冬一夏才能萌發(fā)并且萌發(fā)率低、植株生長緩慢（李運(yùn)昌，1982），常規(guī)育種難以保證市場的需要。能否利用重樓種子數(shù)量多的特點(diǎn)和組織培養(yǎng)具有高繁殖效率的優(yōu)點(diǎn)，直接誘導(dǎo)重樓離體幼胚發(fā)育形成植株？本試驗(yàn)通過離體胚培養(yǎng)技術(shù)來克服重樓種子難以萌發(fā)的缺點(diǎn)，縮短育種周期。用胚培養(yǎng)技術(shù)研究光照和植物生長調(diào)節(jié)劑對華重樓種子離體幼胚萌發(fā)及成苗的影響，旨在使發(fā)育不完全的胚快速發(fā)育，縮短萌發(fā)時(shí)間和出苗時(shí)間，同時(shí)也為重樓屬植物的繁殖研究探索出一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

華重樓種子采自峨眉山生物資源實(shí)驗(yàn)站，挑選新鮮健康、大小均勻一致的華重樓種子備用。

1.2 方法

1.2.1 華重樓種子預(yù)處理 將去除外種皮的華重樓種子用流水沖洗30 min，用濾紙將種子表面的水分吸干，在超凈工作臺中用0.1%的HgCl2消毒10 min、無菌水沖洗5次、每次1 min。消毒后接種在MS培養(yǎng)基中，放入人工氣候箱培養(yǎng)6個(gè)月。人工氣候箱條件設(shè)置：溫度20 ℃，光照1 500 lx，11 h·d-1，濕度65%;溫度4 ℃，光照0 lx，濕度75%，13 h·d-1。

1.2.2 華重樓種胚剝離 將雙目體視鏡下置于超凈工作臺中，用手術(shù)刀和解剖針在雙目體視鏡下將處理6個(gè)月后的華重樓種胚取出并接種于裝有“華重樓離體幼胚生長發(fā)育培養(yǎng)基”的培養(yǎng)皿中。

1.2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對華重樓離體幼胚生長發(fā)育的影響 離體幼胚生長發(fā)育培養(yǎng)基：1/2 MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂+0.5 g·L-1 活性炭+ IAA+GA3，pH為5.8～6。采用2因素3水平L9（23）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究IAA、GA3對華重樓離體幼胚生長發(fā)育的影響，并以不添加IAA、GA3的“離體幼胚生長發(fā)育培養(yǎng)基”為對照組（表1）。每個(gè)培養(yǎng)皿接種4顆華重樓離體幼胚，用封口膠密封培養(yǎng)皿后倒置于人工氣候箱中培養(yǎng)，每個(gè)組重復(fù)6次。

1.2.4 光照對華重樓離體幼胚生長發(fā)育的影響 為研究不同光照對華重樓離體幼胚生長發(fā)育的影響， 將1.2.3中接種的每組培養(yǎng)皿平均分為兩部分，分別置于光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。光培養(yǎng)條件：光照1 500 lx，溫度20 ℃，濕度 65%，11 h·d-1;光照0 lx，溫度15 ℃，濕度75%，13 h·d-1。暗培養(yǎng)條件：光照0 lx，溫度20 ℃，濕度65%，11 h·d-1;光照0 lx，溫度15 ℃，濕度75%，13 h·d-1。此后，每隔2 d分別取樣在雙目體視鏡下觀察華重樓離體幼胚的形態(tài)變化。

1.2.5 植物生長調(diào)節(jié)劑對華重樓成熟胚出苗的影響 子葉長出0.1～0.2 cm視為離體胚發(fā)育成熟。將健康、長勢一致的成熟胚轉(zhuǎn)接到出苗培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成熟胚出苗。出苗培養(yǎng)基：MS+30 g·L-1蔗糖+6.2 mg·L-1硼酸+7 g·L-1瓊脂+0.7 g·L-1活性炭+2，4-D+IAA+ZT+GA3，培養(yǎng)基pH為5.8～6，每組重復(fù)3次。采用4因素3水平L9（34）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究2，4-D、IAA、ZT、GA3對華重樓成熟胚出苗的影響，并以不添加2，4-D、IAA、ZT、GA3的“出苗培養(yǎng)基”為對照組（表2）。培養(yǎng)條件：光照1 500 lx，溫度22 ℃，濕度60%，11 h·d-1;光照0 lx，溫度15 ℃，濕度75%，13 h·d-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照對華重樓離體幼胚發(fā)育的影響

由表3可知，光照條件下，培養(yǎng)到60 d時(shí)離體幼胚生長率僅為22.25%，萌發(fā)率僅為7.5%，絕大多數(shù)離體幼胚在生長過程中褐化死亡。暗培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)到60 d時(shí)離體幼胚生長率為67.5%，萌發(fā)率為26.67%。由此可見暗培養(yǎng)更有利于華重樓離體幼胚生長發(fā)育。

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對華重樓離體幼胚萌發(fā)的影響

由圖1可知，對照組處理下華重樓離體幼胚需要194 d才能萌發(fā)，不同濃度的GA3+IAA組合處理都能顯著促進(jìn)華重樓離體胚萌發(fā)。當(dāng)GA3濃度相同時(shí)，離體幼胚萌發(fā)所需時(shí)間隨IAA濃度增加而延長。說明低濃度IAA促進(jìn)作用強(qiáng)于高濃度IAA。當(dāng)IAA濃度相同時(shí)，不同濃度的GA3都可促進(jìn)離體幼胚萌發(fā)， 促進(jìn)作用由強(qiáng)到弱依次為對不同處理組下華重樓離體幼胚萌發(fā)率達(dá)50%所需時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。除A9組外，其他處理組都能顯著促進(jìn)華重樓離體幼胚萌發(fā)，A4組萌發(fā)率達(dá)50%所需時(shí)間最短，僅需79.67 d，比對照組提前168.66 d（圖2）。

綜上所述，A4組配方（1/2 MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂+0.5 g·L-1活性炭+5 mg·L-1 GA3 +1 mg·L-1 IAA）最有利于華重樓離體幼胚萌發(fā)。

2.3 A4組中華重樓離體幼胚形態(tài)變化

接種時(shí)華重樓離體胚為球形胚（圖版Ⅰ： A， 圖版Ⅱ：A）。在A4中培養(yǎng)24 d離體幼胚分化出胚柄（圖版Ⅰ：B）。對照組需培養(yǎng)75 d才能分化出胚柄（圖版Ⅱ：B），且其胚柄比A4組的胚柄短。在A4組中培養(yǎng)35 d離體幼胚分化出胚根，平均長3 mm（圖版Ⅰ：C），而對照組培養(yǎng)130 d才初步分化出胚根，平均長0.5 mm（圖版Ⅱ：C）。A4組中培養(yǎng)54 d離體幼胚分化出子葉（圖版Ⅰ：D），對照組培養(yǎng)154 d離體幼胚才可初步分化出子葉（圖版Ⅱ：D）。在A4組中繼續(xù)培養(yǎng)11 d離體幼胚繼續(xù)長大，胚根、胚軸、子葉分化更明顯，芽原基初步形成，離體幼胚發(fā)育成熟（圖版Ⅰ：E）。此時(shí)子葉平均長2 mm，胚根平均長5 mm。離體幼胚在對照組中需繼續(xù)培養(yǎng)24 d左右才可形成芽原基（圖版Ⅱ：E）。

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑對華重樓成熟胚出苗的影響

由表4可知，B3、B4、B8處理下成熟胚都不能正常出苗，可能是由于這三組培養(yǎng)基中赤霉素濃度過高（GA3為10 mg·L-1）。除這三組外，其他處理組都可誘導(dǎo)成熟胚出苗。B2組平均出苗時(shí)間最短，僅需43 d，比對照組快38 d。在對照組中不能形成真葉。雖然B2組與B9組誘真葉形成所需時(shí)間最短且無顯著差異，但是B2組中華重樓幼苗莖葉生長速度比B9組快。

綜上所述，B2組配方（MS+30 g·L-1蔗糖+6.2 mg·L-1硼酸+7 g·L-1瓊脂+0.7 g·L-1活性炭+0.5 mg·L-1 2，4-D +1.5 mg·L-1 IAA +1.5 mg·L-1 ZT+ 5 mg·L-1 GA3）最有利于華重樓成熟胚出苗。

2.5 B2組中華重樓成熟胚出苗過程

在B2組培養(yǎng)條件下10 d左右子葉可轉(zhuǎn)綠且胚根明顯變長（圖版Ⅲ：A），43 d左右子葉展開形成幼苗（圖版Ⅲ：B）， 75 d左右形成真葉（圖版Ⅲ：C），培養(yǎng)到150 d時(shí)幼苗生長狀況良好（圖版Ⅲ：D）。在對照組培養(yǎng)條件下10 d左右子葉也可轉(zhuǎn)綠（圖版Ⅳ：A），但胚根生長緩慢，81 d左右才出苗（圖版Ⅳ：B），培養(yǎng)到150 d時(shí)也未見真葉形成，只見幼苗長大（圖版Ⅳ：C）。

3 討論與結(jié)論

光照是植物生長發(fā)育過程中的重要環(huán)境因子，在種子休眠過程中光通過光敏素系統(tǒng)對種子萌發(fā)起調(diào)控作用。雖然光照與離體胚生長發(fā)育間的關(guān)系還有待進(jìn)一步探究，但已有很多研究表明光照會導(dǎo)致愈傷組織褐化。李樹麗（2014）發(fā)現(xiàn)光照強(qiáng)度越強(qiáng)，中華紅葉楊外植體褐化率越高，而暗培養(yǎng)10 d可將其褐化率降低到18%。楊爽等（2012）也發(fā)現(xiàn)野生手掌參離體芽暗培養(yǎng)5～10 d比直接光照培養(yǎng)好，褐化較輕，腋芽萌動(dòng)時(shí)間早、長勢好。湯浩茹等（2000）在黑暗培養(yǎng)條件下成功取得了德國核桃No.120的幼胚、胚軸、子葉。本研究也表明黑暗培養(yǎng)條件更有利于華重樓離體胚生長發(fā)育。其原因可能是在離體胚培養(yǎng)條件下，黑暗條件模擬了華重樓種胚在種子中的生長環(huán)境。另外，采取完全黑暗培養(yǎng)可避免酚類物質(zhì)的毒害（賴鐘雄等，1997）。但紅豆杉（Yang et al.，2010）和伊貝母（李麗，2017）的離體胚更適合在適宜光照條件下發(fā)育。

植物生長調(diào)節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)中起關(guān)鍵作用，對培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度進(jìn)行調(diào)整，可有效地影響植物體內(nèi)源激素水平，影響培養(yǎng)物本身基因表達(dá)，進(jìn)而影響器官形成和組織分化過程，影響培養(yǎng)物形態(tài)重建（李麗等，2018;穆瑢雪等，2018）。生長素會影響胚發(fā)生、根發(fā)育，葉展開等植物生長發(fā)育過程（Woodward & Bartel，2005;Zhao，2010）。GA3能顯著提高西洋參雜種幼胚的萌發(fā)率（雷秀娟，2013），低濃度的IAA有利于伊貝母離體胚生長發(fā)育，而高濃度的IAA則不利于其離體胚的生長發(fā)育（李麗，2017）。本研究結(jié)果與此類似。植物生長調(diào)節(jié)劑不同組合方式不僅影響出苗率還影響出苗方式和幼苗生長狀態(tài)（李程，2013;Tang，2014;Raomai et al.，2014）。本研究中，離體胚成熟胚在B2配方中出苗所用時(shí)間最短，幼苗生長狀態(tài)最好。高濃度的GA3會導(dǎo)致成熟離體胚褐化死亡，在不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的情況下不能誘導(dǎo)形成真葉。離體幼胚A4配方中能快速萌發(fā)，成熟胚在B2配方中能快速出苗可能是因?yàn)橹参锷L調(diào)節(jié)（GA3、IAA）調(diào)控了赤霉素和生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和生物合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室對GA3和IAA組合調(diào)控華重樓種子萌發(fā)機(jī)理進(jìn)行了探究。經(jīng)高通量轉(zhuǎn)錄組測序和pathway通路分析發(fā)現(xiàn)，外源施加GA3和IAA可使GA分解代謝基因GA2ox下調(diào)表達(dá)，GA合成基因GA20ox上調(diào)表達(dá)，GA信號通路中GID1下調(diào)表達(dá)，PIF4上調(diào)表達(dá)。外源施加IAA可使IAA合成通路中YUCCA、ALDH上調(diào)表達(dá)，生長素的受體蛋白AUX1、AUX/IAA、SAUR等上調(diào)表達(dá)。因此，在華重樓離體胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加GA3與IAA或許也可促進(jìn)GA、IAA合成代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而加速離體幼胚成熟與出苗。

綜上所述，黑暗條件有利華重樓離體胚的生長發(fā)育。在本研究條件下，適宜濃度的GA3與IAA組合可使華重樓離體胚快速生長發(fā)育，提前萌發(fā)。適宜濃度的2，4-D+IAA+ZT+GA3組合可縮短成熟華重樓成熟胚出苗時(shí)間，且誘導(dǎo)形成真葉。高濃度的GA3會導(dǎo)致成熟胚死亡。離體胚培養(yǎng)可明顯縮短華重樓種胚萌發(fā)、出苗時(shí)間。

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（責(zé)任編輯 何永艷）