耐鹽菌發(fā)酵對咸鴨蛋蛋清脫鹽及抗氧化活性的影響

陳遠(yuǎn)哲， 黃熙鶯， 魯安娜， 尉鑫欣， 王柳雄， 龔金炎， 肖功年*

（1. 浙江科技學(xué)院 省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州310023；2. 嘉興市家家樂食品有限責(zé)任公司，浙江 嘉興314018）

我國屬于禽蛋生產(chǎn)大國， 鴨蛋產(chǎn)量居世界首位。 浙江省粽子產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)，然而每年因生產(chǎn)咸蛋黃粽而遺留下數(shù)萬噸咸蛋清， 由于其高鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)（7%～12%）以及黏度高，始終無法得到有效地利用。鴨蛋清蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，其氨基酸組成與雞蛋清相似[1]。

目前對咸鴨蛋清的處理除直接用于高品質(zhì)面條[2]，重組魚粒[3-4]外，還將其酶解脫鹽，通過酶解產(chǎn)生的小肽類物質(zhì)大大提高其附加值。 其中最關(guān)鍵的一步便是脫鹽，然而常規(guī)的脫鹽手法如超濾[5]、電滲析等方法，存在堵塞和黏附等問題，同時由于咸蛋清營養(yǎng)價值豐富，易于微生物繁殖，一旦污染導(dǎo)致濾膜難清洗、再生困難等問題。 先酶解[6]，雖然在一定程度上能降低咸鴨蛋蛋清黏度，緩解了膜技術(shù)脫鹽過程存在的過濾膜易堵塞的問題，但在高濃度的鹽環(huán)境中，酶活性會降低或受到抑制，酶解效率降低，酶解咸蛋清的酶及酶解參數(shù)，更是難以選擇和調(diào)控[7]。

作者從腌制食品中篩選出耐鹽菌株Staphylococcus equorum，接種于咸鴨蛋清中，在最適條件下發(fā)酵。 發(fā)酵法的優(yōu)勢是將微生物產(chǎn)酶和酶水解相結(jié)合，簡化生產(chǎn)工藝，降低成本，極大得提高咸鴨蛋蛋清的附加值，為咸鴨蛋蛋清的再生利用提供一條新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金華火腿、咸鴨蛋蛋清：市售；10%含鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的MSA 培養(yǎng)基、牛血清蛋白、VC（Trolox）、乙二胺四乙酸二鈉（分析純）、抗壞血酸（分析純）、二苯代苦味?；杂苫―PPH·）、鐵氰化鉀（分析純）、三氯乙酸（分析純）、氯化鐵（分析純）、菲啰嗪、氯化亞鐵（分析純）、冰乙酸（分析純）、硫代巴比妥酸（分析純）、軟磷脂（分析純）、氫氧化鈉（分析純）。

DV-S 型數(shù)顯粘度計：美國brookfield；UV-5200PC型紫外分光光譜：上海元析儀器有限公司；TG16K-Ⅱ型離心機(jī)：上海趙迪生物科有限公司；UDK159 凱式定氮儀：VELP 公司；DK20 消化爐：VELP 公司；真空冷凍干燥機(jī)；Millipore 超濾離心管。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同發(fā)酵時間咸鴨蛋蛋清粘度的變化參照葉青松[8]等人的方法，取適量待測樣品，置于100 mL 的燒杯中，選用s61 號轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速100 r/min，測定黏度值。

1.2.2 咸蛋清發(fā)酵產(chǎn)物制備分別取適量鴨蛋清和沉淀物加去離子水振蕩30 min， 離心取上清液，0.22 um 膜過濾后， 分別用10 000 和3 000 的超濾膜離心截留分離，保留濃縮液，分別標(biāo)記為組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（空白組），發(fā)酵組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，凍干備用。

1.3 測試方法

1.3.1 鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)及脫鹽率測定參照文獻(xiàn)[9]的方法。

1.3.2 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別采用考馬斯亮藍(lán)法[10]和凱氏定氮法[11]測定。

1.3.3 DPPH·清除能力測定參照文獻(xiàn)[12]的方法。

1.3.4 Fe2+螯合能力的測定參照文獻(xiàn)[13]的方法。

1.3.5 抑制脂過氧化能力的測定參照文獻(xiàn)[14]的方法。

1.3.6 還原力測定參照文獻(xiàn)[15]的方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 咸鴨蛋蛋清發(fā)酵后理化指標(biāo)的測定

2.1.1 咸鴨蛋蛋清發(fā)酵過程黏度的變化咸鴨蛋去掉蛋黃后蛋清一般比較粘稠，據(jù)葉青松等人的報道，咸鴨蛋蛋清不經(jīng)處理，黏度在80 mPa·s 左右，黏度是表征咸蛋清膜法脫鹽效率的重要特征之一[16]，Staphylococcus equorum不同發(fā)酵時間對黏度的影響見圖1。

圖1 咸蛋清不同發(fā)酵時間粘度的變化Fig. 1 Change of viscosity of different fermentation

鴨蛋經(jīng)過腌制，蛋清蛋白逐漸水樣化，但仍具有一定的黏度，從圖1 中得知，0 h 咸鴨蛋清的黏度在20 mPa·s 左右，無論是對膜脫鹽還是膜過濾都會造成膜孔堵塞等嚴(yán)重影響[17]。 接入Staphylococcus equorum菌懸液，發(fā)酵初期，在微生物的作用下黏度迅速下降，隨著發(fā)酵時間的增長，逐漸趨于平緩，但黏度仍不斷的降低，最終達(dá)到零。

2.1.2 發(fā)酵不同時間pH 的變化， 上清液及離心沉淀中的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)酵過程中pH 的變化見圖2。 本次實驗所用的咸鴨蛋蛋清鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，每隔12 小時取一次樣測pH 值，離心后對上清液及沉淀物的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定。 由圖3 可知，沉淀物中鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)大約在3%左右。 咸蛋清發(fā)酵過程中，耐鹽菌分泌的蛋白酶破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[18]，蛋清蛋白與水形成的膠狀結(jié)構(gòu)被破壞，水分析出帶走部分鹽分；隨著pH 的降低，部分蛋白質(zhì)及肽類物質(zhì)，達(dá)到其等電點并形成沉淀[19]，此時發(fā)酵液已明顯分層，通過離心取沉淀物，大部分鹽仍留在上清液中，從而達(dá)到脫鹽的目的。3%左右的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)與新鮮咸蛋清相比，脫鹽率可達(dá)70%，且擠出多余的水分后沉淀物中的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)會進(jìn)一步降低。 沉淀物凍干粉中的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)只有15%，也已遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于咸蛋清凍干粉中38%的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)，見圖4。

圖2 發(fā)酵不同時間pH 的變化Fig. 2 pH of different fermentation

2.1.3 離心沉淀物凍干粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)由圖5可知，0 小時代表新鮮咸鴨蛋蛋清，由于該耐鹽菌株在生長過程中產(chǎn)酸，沉淀物中蛋白質(zhì)來源大致有三部分組成，菌體、遇酸沉淀的蛋白質(zhì)以及部分不可溶的蛋清蛋白。發(fā)酵36 h 的沉淀物粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于凍干咸蛋清粉，鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)大大低于凍干咸蛋清，是一種很好的高蛋白、低含鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的飼料添加成分。 隨著發(fā)酵時間的延長，微生物活動消耗，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低。

圖3 發(fā)酵不同時間上清液及離心沉淀中的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 3 Salt content of different fermentation of the supernatant and precipitate

圖4 發(fā)酵不同時間沉淀物凍干粉鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 4 Salt content of differentfermentation of the freezedried precipitate

圖5 發(fā)酵不同時間沉淀物凍干粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 5 Protein content ofdifferent fermentation of the freeze-dried precipitate

2.2 咸蛋清發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的測定

2.2.1 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，表明在0~0.1 mg 范圍內(nèi)牛血清蛋白的質(zhì)量濃度與吸光度呈較好的線性關(guān)系， 線性回歸方程為Y=6.982 6X+，0.009 17，R2=0.997 0。

圖6 牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 6 Standard curve of bovine serum albumin solution

2.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物DPPH·清除能力測定二苯代苦味?；杂苫―PPH·）是一種穩(wěn)定的自由基，在波長517 nm 處有最大吸收峰， 當(dāng)體系中有強(qiáng)抗氧化劑存在時，孤對電子會被配對，吸光值下降，其褪色程度與結(jié)合的電子數(shù)有定量關(guān)系[20]，見圖7。

圖7 發(fā)酵產(chǎn)物體外DPPH·自由基清除活性Fig. 7 Scavenging activity of different fermentation samples to DPPH·in vitro

比較圖7 中空白組和發(fā)酵組間發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵組組分Ⅲ的IC50值遠(yuǎn)低于對照組，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性， 有研究發(fā)現(xiàn)一些特定氨基酸 （如Glu、 Asp、Lys、Leu 和Ala） 的存在能夠增強(qiáng)肽的抗氧化性。Lys 等因其側(cè)鏈有氨基或羧基， 而具有清除自由基和螯合金屬離子的能力[21-22]。 空白組由于蛋清蛋白相對分子質(zhì)量均在10 000 以上，故超濾離心后得不到組分Ⅱ、Ⅲ，檢測不到抗氧化活性。 發(fā)酵組組分Ⅰ檢測不到活性的原因，猜測是因為具有抗氧化活性的小肽含量比較少，且復(fù)雜的環(huán)境成分對實驗有一定的干擾。 由此可得出耐鹽菌發(fā)酵后能增強(qiáng)咸蛋清蛋白的抗氧化活性。

2.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物Fe2+螯合能力的測定比較圖8 中空白組和發(fā)酵組發(fā)現(xiàn)，其還原力與相對分子質(zhì)量大小有一定關(guān)系。相對分子質(zhì)量越小，還原力越強(qiáng)。發(fā)酵組組分Ⅲ的IC50遠(yuǎn)小于對照組，具有極強(qiáng)的抗氧化活性，較空白組而言，是從無到有的突破；發(fā)酵組組分Ⅱ的IC50雖然大于對照組， 但與空白組相比較，仍具有較強(qiáng)的抗氧化活性。 空白組的三個組分均檢測不到抗氧化活性，由此可得出，耐鹽菌發(fā)酵有助于增強(qiáng)咸蛋清蛋白的抗氧化活性。 有研究表明[23-24]，F(xiàn)e2+螯合能力不僅與樣品中雜環(huán)化合物的含量也有較大的關(guān)聯(lián)，與樣品中的大分子物質(zhì)也有很大的關(guān)聯(lián)。

圖8 發(fā)酵產(chǎn)物體外Fe2+螯合能力Fig. 8 Fe2 + chelating ability of different fermentation samples in vitro

2.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物抗脂質(zhì)過氧化能力的測定該方法利用多不飽和脂肪酸在氧化過程中，產(chǎn)生的丙二醛和硫代巴比妥酸反應(yīng)生成紅色物質(zhì)， 該物質(zhì)在532 nm 處有強(qiáng)吸收峰?？寡趸瘎┠芤种贫嗖伙柡椭舅岬淖詣友趸?，丙二醛的生成量隨之降低，紅色變淡甚至消失，因此可以通過測定反應(yīng)溶液的吸光值來檢測產(chǎn)物的抗氧化效果[25]，見圖9。

圖9 發(fā)酵產(chǎn)物體外抑制脂質(zhì)過氧化能力Fig. 9 Inhibiting lipid peroxidation ability of different fermentation samples in vitro

從圖9 可知， 在微生物分泌的蛋白酶的作用下，咸鴨蛋蛋清具有抗脂質(zhì)過氧化能力的基團(tuán)逐漸暴露出來，表現(xiàn)出了一定的抗氧化活性[26]。但從抑制脂質(zhì)過氧化能力來看，發(fā)酵組組分Ⅱ、Ⅲ的IC50值相較于對照組來說并不是很優(yōu)秀，對空白組而言卻有質(zhì)的突破。 發(fā)酵組組分Ⅰ檢測不到活性的原因，猜測是因為具有抗氧化活性的小肽含量相對較少，且復(fù)雜的環(huán)境成分對實驗有一定的干擾。 由此可得出，耐鹽菌發(fā)酵有助于增強(qiáng)咸蛋清蛋白的抑制脂質(zhì)過氧化能力。

2.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物還原力測定具有抗氧化能力的物質(zhì)提供的電子， 能使Fe3+還原成Fe2+，K3Fe（CN）6在還原劑的作用下被還原成K4Fe（CN）6，與Fe3+反應(yīng)能形成普魯士藍(lán)，其在700 nm 附近有強(qiáng)吸收峰[27]。

還原力是基于加入發(fā)酵離心產(chǎn)物 （還原性物質(zhì)）后，體系中Fe3+轉(zhuǎn)化為Fe2+來檢測的，吸光值越大樣品的還原力越強(qiáng)。 如圖10 所示，VC 當(dāng)量越大表明樣品還原力越強(qiáng)，比較發(fā)酵組組分Ⅱ、Ⅲ可知，其還原力與相對分子質(zhì)量大小呈負(fù)相關(guān)，相對分子質(zhì)量在3 000 以下， 在蛋白酶的作用下一些極性或帶電的氨基酸側(cè)鏈較多地暴露出來[28]，從而增加了還原能力。 比較發(fā)酵組的組分Ⅱ、Ⅲ，其還原力隨相對分子質(zhì)量的減小而增強(qiáng)，這與Guillen G 等人[29]的研究結(jié)果一致。 空白組的三個組分均檢測不出還原能力。 由此可得出，耐鹽菌發(fā)酵后能增強(qiáng)咸蛋清蛋白的抗氧化活性。

圖10 發(fā)酵產(chǎn)物體外還原力Fig. 10 Reducing ability of different fermentation samples in vitro

3 結(jié) 語

從金華火腿中篩選得到的耐鹽菌，37 ℃振蕩發(fā)酵48 h，6 000 r/min 離心取沉淀物， 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為12%，與新鮮鴨蛋清無異，但鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅剩3%左右， 脫鹽率能達(dá)到70%， 相較于咸鴨蛋清10%的含鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)大大降低；凍干后，鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%~18%，大大低于咸蛋清38%；粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)55%~58%，略高于咸蛋清49%。

沉淀物加水振蕩復(fù)溶， 取上清液分別經(jīng)過10 000 和3 000 的超濾膜離心分離， 得到小于3 000 及3 000~10 000 的物質(zhì)，通過四個體外抗氧化活性體系共同得出， 咸鴨蛋蛋清在發(fā)酵過程中，耐鹽菌產(chǎn)生的蛋白酶能在較高鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的環(huán)境中有效地降解蛋清蛋白， 經(jīng)過3 000 的超濾膜離心后得到小于3 000 的小肽，具有極強(qiáng)的抗氧化活性。