紫外-可見分光光度法測定防暑清熱飲中總黃酮和總多糖含量

李 杰，楊育儒，王慶芬，鄭紹忠，陳錦珊（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇九醫(yī)院/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院制劑科，福建 漳州 363000）

福建地處我國南方，夏季氣溫高、濕度大，駐地部隊經(jīng)常需要組織開展高強度的軍事作業(yè)，極易發(fā)生中暑[1]。聯(lián)勤保障部隊第九〇九醫(yī)院協(xié)定處方防暑清熱飲由廣藿香、白茅根、菊花、薄荷、枸杞等藥材組成，具有芳香化濕、清熱解毒、解渴生津之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，中藥材菊花、薄荷、白茅根及中藥復(fù)方制劑中的總黃酮和總多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、生殖功能保護和改善等作用[2-6]，總黃酮和總多糖是防暑清熱飲的主要活性成分，因此，對方中總黃酮和總多糖進行質(zhì)量控制尤為重要[7-13]。

1 儀器與試劑

電子分析天平（AUX220，日本-島津）；紫外-可見分光光度計（2550，島津-蘇州）；低速離心機（LD5-2A，北京醫(yī)用離心機廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH2 江蘇金壇市江南儀器廠）；華美冷柜（SY-176，杭州華美電冰箱廠）。蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707），無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201205）。無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、濃硫酸、苯酚等試劑均為分析純，水為純化水。防暑清熱飲（批號：20190107、20181212、20181210，規(guī)格：100 ml/瓶，第九〇九醫(yī)院制劑科）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1 蘆丁對照品溶液

精確稱取蘆丁對照品14.8 mg，置于50 ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為296 μg/ml的蘆丁對照品溶液。

2.1.2 葡萄糖對照品溶液

精密稱取105 ℃下干燥至恒質(zhì)量的無水葡萄糖對照品10.92 mg，置于100 ml量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為109.2 μg/ml的葡萄糖對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 總黃酮供試品溶液

精密量取防暑清熱飲上清液10 ml，置100 ml燒杯中，攪拌下加95%乙醇，使含醇量達65%，冷藏5 h后取出，4 500 r/min離心10 min，傾取上清液，轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，加65%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 總多糖供試品溶液

取100 ml防暑清熱飲，4 500 r/min離心10 min，再精密量取上清液1 ml，置100 ml量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 紫外檢測波長的確定

取適中濃度蘆丁、葡萄糖對照品溶液及供試品溶液，采用紫外-可見分光光度法在200～800 nm范圍內(nèi)進行全波長掃描。結(jié)果表明，蘆丁與總黃酮的最大吸收波長均為508 nm，無水葡萄糖和總多糖最大吸收波長為487 nm，見圖1。

2.4 測定方法

2.4.1 亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法

精密量取蘆丁對照品溶液和供試品溶液各5.0 ml，分別置于25 ml量瓶中，加入65%乙醇6 ml，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻放置6 min后，加入10%硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻放置6 min后，加入4%氫氧化鈉溶液10.0 ml，再加水至刻度，搖勻放置15 min，以相應(yīng)的試劑作為空白對照，于508 nm處測定其吸光度。

2.4.2 苯酚硫酸法

精密量取葡萄糖對照品溶液0.5 ml和供試品溶液1.0 ml，分別置于25ml具塞刻度試管中，分別加純化水至2 ml，再各加50 mg/ml苯酚溶液1.0 ml、濃硫酸5.0 ml，搖勻，靜置5 min，置沸水浴中顯色15 min，冰水浴冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑作為空白對照，于487 nm處測定其吸光度。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察

（1）總黃酮線性關(guān)系：精密量取“2.1.1”項下蘆丁對照品溶液0、1、2、3、4、5 ml，分別置于25 ml量瓶中，按“2.4.1”項下方法制備系列濃度對照品溶液，以65%乙醇同法制備參比溶液，在508 nm波長處測定吸光度，以濃度（μg/ml）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線?；貧w方程：A=0.011C-0.005，r=0.999 5。表明蘆丁對照品濃度在0.00～59.20 μg/ml范圍內(nèi)吸光度呈良好線性關(guān)系。

（2）總多糖線性關(guān)系：精密量取“2.1.2”葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 ml，分別置于25 ml具塞刻度試管中，按照“2.4.2”項下自“分別加純化水至2 ml，……，同法操作的相應(yīng)溶劑為參比溶液”，在487 nm波長處測定吸光度。以濃度（μg/ml）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程：A=0.009C，r=0.999 5，表明葡萄糖對照品濃度在10.92～109.20 μg/ml范圍內(nèi)吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.5.2 精密度考察

精密量取濃度分別為296、54.6 μg/ml蘆丁和葡萄糖對照品溶液，蘆丁對照品溶液按總黃酮線性關(guān)系考察方法在508 nm波長處重復(fù)測定6次，計算得RSD為0.14%，無水葡萄糖對照品溶液顯色后在487 nm波長處重復(fù)測定6次，計算得RSD為0.07%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性考察

分別精密量取防暑清熱飲（批號：20190107）6份，按“2.2”項下方法制備總黃酮和總多糖供試品溶液，分別在508、487 nm波長處進行測定。結(jié)果總黃酮平均含量為0.825 mg/ml，RSD為0.59%，總多糖平均含量為4.434 mg/ml，RSD為2.0%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性考察

（1）總黃酮穩(wěn)定性：精密量取按“2.2.1”項下方法制備防暑清熱飲（批號:20190107）5.0 ml，按“2.4.1”項下硝酸鋁顯色法，以65%乙醇同法制備參比溶液，分別于0、10、15、20、30、40 min在508 nm波長處測定吸光度，標準曲線法計算總黃酮含量平均值為0.814 mg/ml，RSD為1.82%（n=6），表明本方法在40 min內(nèi)穩(wěn)定。

（2）總多糖穩(wěn)定性：精密量取按“2.2.2”項下方法制備防暑清熱飲（批號:20190107）1.0 ml，按“2.4.2”項下苯酚硫酸顯色法，以純化水同法制備參比溶液，分別于0、10、20、30、40、60 min在487 nm波長處測定吸光度，標準曲線法計算總多糖含量平均值為4.488 mg/ml，RSD為0.5%（n=6），表明本方法在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收率試驗

（1）總黃酮加樣回收試驗：精密量取防暑清熱飲上清液（批號：20190107）5.0 ml，按“2.2.1”項下制備供試品溶液。精密量取供試品溶液5 ml（82.5 μg/ml），置于25 ml量瓶中，共6份，分別加入蘆丁對照品溶液（296 μg/ml）1.5 ml，按“2.4.1”項下硝酸鋁顯色法，以65%乙醇為參比液，在508 nm波長處測定吸收度，標準曲線法計算總黃酮含量，并計算得出回收率平均值為104.4%，RSD為1.11%（n=6），結(jié)果見表1。

（2）總多糖加樣回收試驗：精密量取防暑清熱飲上清液（批號：20190107）0.5 ml，按“2.2.2” 項下制備供試品溶液。精密量取供試品溶液（22.17 μg/ml）1.0 ml，置于25 ml具塞比色管中，共6份，分別加入葡萄糖對照品溶液（109.2 μg/ml）0.2 ml，按“2.4.2”項下苯酚硫酸法，以純化水為參比液，在487 nm波長處測定吸收度，用標準曲線法計算總黃酮含量，并計算得回收率平均值為104.8%，RSD為1.88%（n=6），結(jié)果見表1。

2.6 樣品含量測定

取3個批號的防暑清熱飲樣品（批號：20181210、20181212、20190107），各3份，按“2.2”項下方法制備的防暑清熱飲總黃酮和總多糖供試品溶液，并分別按照“2.4”項下方法操作，分別在508 nm和487 nm波長處進行測定，將所測得的吸光度值代入回歸方程，計算總黃酮和總多糖含量。結(jié)果見表2。

表1 防暑清熱飲總黃酮和總多糖加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

表2 防暑清熱飲總黃酮和總多糖含量測定結(jié)果(n=3，μg/ml)

3 討論

防暑清熱飲為醫(yī)院協(xié)定處方，可用于夏季作業(yè)及訓(xùn)練保障，方中總黃酮和總多糖協(xié)同發(fā)揮作用。通過測定方中總黃酮和總多糖的含量，更好地控制制劑質(zhì)量，發(fā)揮保障作用。

防暑清熱飲總黃酮供試品溶液前處理方法的確定：通過查閱文獻及實驗條件摸索，確定65%乙醇進行醇沉，冷藏5 h，4 500 r/min離心10 min。其中，若乙醇濃度過低會使總黃酮提取不完全，而乙醇濃度過高不易定容至準確濃度，冷藏時間考察了5、10、20 h，含量差別不大。另外，本實驗對防暑清熱飲本體液進行光譜掃描，在508 nm和487 nm處吸收峰很弱，基本無干擾，故采用溶劑空白為對照（圖1）。

金屬離子絡(luò)合法是測定總黃酮含量最為常見的方法，其原理是在一定條件下，黃酮與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成有顏色的絡(luò)合物，通過比色法測定總黃酮含量，本實驗通過對三氯化鋁法和亞硝酸鈉法考察，發(fā)現(xiàn)亞硝酸鈉法顯色測量的總黃酮結(jié)果較好。經(jīng)過比較防暑清熱飲經(jīng)5、10、20倍稀釋后在508 nm處測得吸光度值，5倍稀釋后供試液的A508落在0.3～0.7之間，確定5倍為適宜的稀釋倍數(shù)。穩(wěn)定性試驗發(fā)現(xiàn)在40 min內(nèi)比較穩(wěn)定，建議反應(yīng)完成后盡快測定，避免測量誤差。

苯酚硫酸法測總多糖是利用糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物。經(jīng)過比較防暑清熱飲稀釋1、50、100倍后在487 nm處測得吸光度值，100倍稀釋后供試液的A487落在0.3～0.7之間，100倍為適宜的稀釋倍數(shù)?？偠嗵菧y定結(jié)果影響因素比較多，對測量用具的潔凈度要求較高，每種試劑加入的方式對結(jié)果影響明顯，因此，苯酚應(yīng)臨用現(xiàn)配，向樣品中加入苯酚溶液需要迅速搖勻，在硫酸沿壁流下加完立即搖勻。

本實驗建立的總黃酮和總多糖供試品溶液制備方法簡便、快速、準確、靈敏，可作為防暑清熱飲質(zhì)控方法，因不同批次中藥材質(zhì)量差異較大，后續(xù)需要經(jīng)過多批次測定以確定質(zhì)控標準。