東北天南星生物堿對草地貪夜蛾Sf 21細胞凋亡的影響

劉麗華，于 洋，白 巖，劉業(yè)輝，于凱歌，丁 寧

當前，由于使用化學農(nóng)藥引發(fā)的環(huán)境污染、殘留、病蟲害抗藥性等問題，極大地威脅了人類本身及環(huán)境的安全.針對現(xiàn)今農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展理論，開發(fā)植物源農(nóng)藥是解決這些問題的關鍵性手段，利用天然植物活性成分創(chuàng)制新型、高效、低毒殺蟲劑備受人們重視［1].長白山野生植物資源非常豐富，其中有毒植物資源種類繁多，達到160多種，它們能夠產(chǎn)生生物堿、類萜、類黃酮、精油等多種性質(zhì)各異的次生代謝物，在殺蟲、抑菌等方面均有一定表現(xiàn)［2].長白山大多有毒植物在醫(yī)藥上被使用，少數(shù)在民間作為殺蟲農(nóng)藥使用，極大地限制了長白山有毒植物的應用和開發(fā).

東北天南星（Arisaema amurense Maxim.）屬天南星科天南星屬多年生草本植物，為常用中藥，具有燥濕化痰、祛風止痙、散結(jié)消腫的功效［3].其化學成分以生物堿、黃酮類、多糖為主，另外還有氨基酸、脂肪酸及甾醇等成分［4].現(xiàn)代藥理研究表明，生物堿具有顯著的生物活性，是其重要的有效成分之一，具有抗腫瘤［5]、抗菌［6]、抗氧化［7]、昆蟲毒殺［8]等作用.目前，對天南星的研究在化學成分和藥理作用及機制等方面都有新的報道［9-10]，但在農(nóng)業(yè)害蟲生物防治方面，其殺蟲機制未見報道.

草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）也稱秋黏蟲，廣泛分布于美洲大陸且遷飛能力較強的毀滅性農(nóng)業(yè)害蟲［11].草地貪夜蛾幼蟲可取食玉米、水稻、小麥、棉花等300多種寄主作物［12].自2019年1月云南省首次發(fā)現(xiàn)該蟲危害玉米以來，其發(fā)生危害地區(qū)逐漸擴大，目前已有20 多個?。▍^(qū)）發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾［13].鑒于草地貪夜蛾在我國擴散速度之快，潛在地理分布之廣，危害作用之強，故以草地貪夜蛾Sf 21 細胞系為靶標，利用植物源殺蟲劑對其殺蟲活性及機制進行研究尤為重要.

為此，本文以顯著殺蟲活性的長白山有毒植物東北天南星為試驗對象，通過現(xiàn)代提取分離手段制備其生物總堿，采用四甲基偶氮唑藍比色法（MTT 法）檢測東北天南星生物總堿對離體培養(yǎng)草地貪夜蛾Sf 21 細胞毒性影響，并利用流式細胞儀檢測對其細胞凋亡的影響，從而在細胞及分子水平上深入研究和揭示天南星毒性作用機制，以期為天南星科植物開發(fā)為植物源殺蟲劑提供理論和實驗依據(jù).

1 材料和方法

1.1 細胞與試劑

Sf 21細胞株由江蘇大學生命科學學院惠贈.細胞培養(yǎng)基TC-100 及胎牛血清購自Invitrogen公司，MTT 購自華美生物工程公司，二甲基亞砜（DMSO）為Sigma 公司產(chǎn)品，Annexin V 細胞凋亡試劑購于美國Biolegend公司.東北天南星采自吉林省通化市頭道溝，由通化師范學院植物組教研室鑒定確認.

1.2 方法

（1）東北天南星生物總堿的提取.稱取東北天南星干燥的地下根莖50 g，采用甲醇浸提，減壓蒸餾獲得粗提取物，進一步分離出生物總堿，生物總堿的提取方法參考武剛毅等［14]的方法進行.用DMSO 溶解東北天南星生物堿，臨用前用TC-100 培養(yǎng)液稀釋成質(zhì)量濃度為10 ug/mL、30 ug/mL、50 ug/mL的藥液，置于4 ℃培養(yǎng)箱中備用.

（2）細胞培養(yǎng).Sf 21 細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清的TC-100 培養(yǎng)基于27 ℃培養(yǎng).2～3 d換培養(yǎng)基1次，細胞鋪滿培養(yǎng)瓶90%以上面積時應及時分瓶傳代.

（3）MTT 法測定細胞抑制率.取對數(shù)生長期的Sf 21 細胞，調(diào)整細胞濃度為2×105個/mL，以100 uL/孔種入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，各試驗孔中加入東北天南星藥液，使培養(yǎng)液中天南星終濃度分別為10 ug/mL、30 ug/mL、50 ug/mL，對照組加入100 uL 培養(yǎng)液，調(diào)零孔不加細胞，只加培養(yǎng)液.每組均設3 個重復，置于27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，各培養(yǎng)孔中加入80 uL培養(yǎng)液和20 uL MTT溶液（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 uL DMSO，置微量震蕩器低速震蕩10 min，使形成的甲臜完全溶解，490 nm酶標儀檢測各濃度的吸光值，計算抑制率的公式如下：

（4）流式細胞儀測定細胞凋亡率.Sf 21 細胞以2×105個/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，經(jīng)不同濃度東北天南星作用48 h 后，采用Annexin V-FIFC/PI雙熒光標記，根據(jù)凋亡試劑盒說明，用流式細胞儀分析Sf 21細胞凋亡情況.

（5）數(shù)據(jù)分析.圖表采用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析.

表1 不同濃度東北天南星生物總堿對Sf 21細胞的抑制作用（xˉ±s）

2 結(jié)果與分析

2.1 東北天南星生物堿對Sf 21細胞增殖的影響

與對照組相比，不同濃度東北天南星生物總堿對Sf 21 細胞均有抑制作用，如表1 所示，并且隨著處理時間的延長及藥物濃度的增大，抑制率明顯增加.50 ug/mL 劑量組在72 h 基本上不存在活細胞.提示藥物作用具有明顯的劑量和時間依賴性.

2.2 東北天南星生物堿對Sf 21細胞凋亡的影響

不同濃度的東北天南星生物總堿分別作用于Sf 21細胞48 h后，分別取各處理細胞經(jīng)Annexin V-FIFC/PI 雙染后，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率.結(jié)果表明，與對照組相比，各劑量組均可誘導Sf 21 細胞發(fā)生凋亡，且隨著東北天南星質(zhì)量濃度（10 ug/mL、30 ug/mL、50 ug/mL）的增加，細胞凋亡率也逐漸增加，分別為18.4%、35.2%、62.5%.表明東北天南星誘導Sf 21 細胞凋亡作用呈劑量依賴性.具體細胞凋亡率如圖1所示.

圖1 不同處理條件下Sf 21細胞凋亡率

3 討論

近年來，由于化學農(nóng)藥的弊端日益凸顯（殘留、抗性、環(huán)境污染），特別是環(huán)境保護和生態(tài)平衡問題，使化學農(nóng)藥受到嚴重挑戰(zhàn).對植物源殺蟲劑的研究與開發(fā)是當前創(chuàng)新型農(nóng)藥研制的熱點［15].東北天南星作為具有殺蟲活性植物之一，對其細胞凋亡機制的研究有助于為把東北天南星開發(fā)為植物源殺蟲劑提供理論與實驗依據(jù).關于東北天南星根提取物對細胞的毒性［16]和對細胞凋亡的影響［17-18]等已有一些報道，但對于昆蟲細胞的毒性及細胞凋亡作用的研究還未見報道.

本研究中東北天南星對Sf 21細胞在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)抑制作用較明顯，其細胞抑制率與藥物濃度、作用時間呈劑量依賴性，即隨著東北天南星藥物濃度的增加，抑制率逐漸增加，隨著作用時間的延長，抑制率也相應增加.這與湯建華［19]等用天南星醇提取液作用人胃癌細胞結(jié)果相同.

流式細胞儀檢測了Sf 21 細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，東北天南星具有較強的誘導Sf 21 細胞凋亡的作用，隨著藥液質(zhì)量濃度增大，細胞凋亡的比例明顯增加，誘導細胞凋亡作用增強.由此可見，天南星生物堿可能是通過誘導昆蟲細胞凋亡達到殺蟲的目的，黃維林［20]等研究結(jié)果表明，肺癌A549細胞在天南星總黃酮作用下發(fā)生凋亡也與藥物濃度呈劑量相關性.但由于昆蟲細胞和癌癥細胞理化性質(zhì)的不同，其誘導凋亡的網(wǎng)絡和途徑也不同，因此對其凋亡機制研究還有待于進一步研究.同時，本文研究的是東北天南星生物總堿，今后將進一步分離純化殺蟲活性成分，明確各種活性成分的作用及相互關系，尋找具有農(nóng)藥活性的先導化合物，進而研制出新型植物源農(nóng)藥.