自噬增強拮抗褪黑素誘導(dǎo)的胃癌細胞增殖抑制作用

朱輝 ，江婷婷 ，黃曉琪 ，王丁杰 ，郭曉蘭 ，周瑞祥 ，劉卉 *

（福建醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院干細胞工程與再生醫(yī)學(xué)省高等學(xué)校重點實驗室，2臨床醫(yī)學(xué)部，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，福州 350122)

根據(jù)2018全球癌癥統(tǒng)計報告，中國的胃癌發(fā)病率和死亡率分別居癌癥發(fā)病和死亡的第3位和第2位[1]。由于約70%胃癌確診時已為中晚期，化療是主要治療方法[2]，但由于化療藥物不良反應(yīng)明顯及多藥耐藥的存在使得胃癌化療預(yù)后不佳。褪黑素(melatonin, MLT)是一種主要由松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，大量研究表明，褪黑素對于神經(jīng)膠質(zhì)瘤[3]、甲狀腺癌[4]、乳腺癌[5]、胃癌[6]等多種腫瘤皆有明顯的抑制作用。細胞自噬是廣泛存在于真核細胞中的一種生命現(xiàn)象，細胞自噬在胃癌細胞的生長、侵襲和抗腫瘤藥物的療效上扮演著雙重角色[7]。一方面細胞自噬可降解功能失調(diào)的蛋白和細胞器，防止細胞不必要產(chǎn)物的毒性積聚，具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[8]；另一方面，自噬保護一些腫瘤細胞免受營養(yǎng)剝奪和低氧條件的傷害，這是腫瘤細胞抵御嚴酷的腫瘤微環(huán)境和其他抗癌治療的手段之一[9,10]。細胞自噬在褪黑素抑制胃癌細胞增殖過程中的作用仍不明確。本研究建立褪黑素體內(nèi)外干預(yù)胃癌細胞的模型，應(yīng)用透射電鏡觀察法、CCK-8法和Western blot法等對腫瘤細胞自噬相關(guān)指標進行檢測分析，探討細胞自噬在褪黑素抗胃癌過程中的作用，為進一步完善褪黑素抗胃癌細胞增殖機制提供基礎(chǔ)依據(jù)。

材料與方法

1 荷癌動物模型建立及分組

SPF級雄性615近交系小鼠24只，體重（20±2）g，6～8周齡，購自中國科學(xué)院天津血液病研究所[生產(chǎn)許可證號：SCXK（津）2015- 0001]，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始實驗。24只小鼠隨機分為生理鹽水溶媒組，25mg/kg褪黑素組，50mg/kg褪黑素組各8只。小鼠前胃癌細胞株（murine foregastric carcinoma,MFC）細胞計數(shù)后，按7.5×105個細胞/小鼠，右腋皮下注射，接種后小鼠每日正常飲水、進食，一周后小鼠右腋下可觸及明顯腫塊，說明荷瘤模型建立成功。生理鹽水溶媒組：荷瘤成功后（接種第6天起）每天腹腔注射生理鹽水100mg/kg，含0.1%無水乙醇；25mg/kg褪黑素組：荷瘤成功后（接種第6天起）每天腹腔注射MLT 25mg/kg；50mg/kg褪黑素組：荷瘤成功后（接種第6天起）每天腹腔注射MLT 50mg/kg。褪黑素臨用前以無水乙醇溶解，再加生理鹽水配制，使乙醇濃度為0.1%，置4℃遮光保存?zhèn)溆?。褪黑素每天腹腔注射時間為17:00，注射7d后取腫瘤組織。

2 腫瘤組織取材測量及HE染色

首先引頸處死小鼠，酒精消毒后剪開右腋皮膚,完整剝離腫瘤組織并測量腫瘤長徑和短徑，按公式計算腫瘤體積：體積（mm3）=短徑2×長徑/2。將剝離的腫瘤組織切成大小約0.5cm×0.5cm×0.5cm的組織塊，4%多聚甲醛固定。酒精梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋。將包埋好的蠟塊切成5μm厚的薄片，常規(guī)HE法染色：脫蠟復(fù)水，PBS沖洗后，蘇木精浸染3min，自來水沖洗1min，0.5%鹽酸乙醇分化3s，0.2%氨水返藍30s，蒸餾水水洗1min，1%伊紅浸染約20s，自來水沖洗1min，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

3 細胞培養(yǎng)及分組

小鼠前胃癌細胞（MFC）購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，培養(yǎng)基為RPMI-1640，含10%胎牛血清。用0.25%胰蛋白酶消化30s，每隔3d（90%細胞融合時）傳代，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的MFC細胞，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后進行藥物干預(yù)并分為4組：空白對照組（不加任何藥物干預(yù)，只加等量的培養(yǎng)液）；褪黑素組（加入1mmol/L MLT)；自噬抑制劑3-MA組[8mmol/L 3-MA（上海源葉生物科技有限公司）]；聯(lián)合給藥組（8mmol/L 3-MA 預(yù)處理細胞1h后加入1mmol/L MLT）。

4 CCK-8法檢測MFC細胞增殖活性

取對數(shù)生長期的MFC細胞，以5000個/孔接種于96 孔板，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后進行不同分組藥物干預(yù)。每組設(shè)6個復(fù)孔，給藥24h后每孔加入10μl CCK-8溶液（日本同仁化學(xué)研究所），37℃孵育1h，450nm 測定吸光度。按下列公式計算：腫瘤細胞增殖率=（各加藥孔吸光度均值-空白孔吸光度均值）/（對照組吸光度均值-空白孔吸光度均值）×100%。

5 自噬的透射電鏡術(shù)經(jīng)檢測

荷癌動物腫瘤組織：將腫瘤組織切成0.5mm3大小的小塊，加入足量的電鏡固定液（3%戊二醛和1.5%多聚甲醛的混合液，pH7.2）固定24h，送福建醫(yī)科大學(xué)電鏡室進行透射電鏡包埋、超薄切片和檢測。

MFC細胞：用0.25%的胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的MFC細胞，以1.0×106個接種于10cm細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后進行分組藥物干預(yù)。給藥24h后收集對照組和MLT組的細胞，1000r/min離心5min，吸凈培養(yǎng)液后加入足量的電鏡固定液（3%戊二醛和1.5%多聚甲醛的混合液，固定4h），送福建醫(yī)科大學(xué)電鏡室進行透射電鏡包埋、超薄切片和檢測。

6 Western blot 法檢測beclin-1和LC3-Ⅱ水平

荷癌動物腫瘤組織：取新鮮腫瘤組織，每20mg加300μl裂解液（RIPA強裂解液297μl，PMSF蛋白酶抑制劑3μl），充分研磨，然后4℃、12000 r/min離心10min。取上清BCA法測定蛋白濃度，配置12.5%SDS-PAGE分離膠與5%濃縮膠，取20μg蛋白上樣，電泳（100V，1.5h），電轉(zhuǎn)（70V，90min），Western blot封閉液封閉1h后分別與β-actin（1:5000，CST公司）、beclin-1(1:2500，Abcam公司）、LC3-Ⅱ（1:2500，CST公司）一抗工作液反應(yīng)，4℃孵育過夜，再用HRP標記的二抗（1:6000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）室溫孵育1h，運用BeyoECLPlus工作液顯色，BIO-RAD ChemiDocTMTouch Imaging System發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

MFC細胞：取對數(shù)生長期的MFC細胞，以每孔1.0×105個細胞密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后進行不同分組藥物干預(yù)。給藥24h后收集細胞，棄培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗兩次，每孔加100μl裂解液（RIPA強裂解液99μl，PMSF蛋白酶抑制劑1μl），冰上裂解15min后4℃、12000r/m離心10min。取上清液，BCA法測定其蛋白濃度，配置12.5% SDS-PAGE分離膠與5%濃縮膠，取30μg蛋白上樣，其他步驟同組織檢測。

7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)行單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗進行顯著性分析，以P＜0.05為有顯著性差異。

結(jié) 果

1 荷胃癌小鼠及腫瘤組織病理學(xué)特點

本研究成功建立荷胃癌615小鼠（圖1C）。腫瘤組織切片HE染色顯示，細胞核大深染，核質(zhì)比明顯增大，呈現(xiàn)出病理性核分裂像（圖1D）。

圖1 荷胃癌小鼠及腫瘤組織HE染色。A，小鼠右腋下可見明顯腫塊（箭頭）；B，酒精消毒后剪開右腋皮膚；C，完整剝離腫瘤組織并測量腫瘤長短徑；D，腫瘤組織HE染色Fig. 1 Gastric cancer-bearing mice and HE staining of tumor tissues. A, the mouse has a visible mass on the right armpit (shown by an arrow); B, the right skin is cut after alcohol disinfection; C, the tumor tissue is completely dissected and the tumor long and short diameters are measured; D, HE staining of tumor tissue

2 褪黑素體內(nèi)抑制小鼠胃癌增殖

對不同劑量褪黑素對腫瘤體積的影響觀察顯示：與對照組相比，兩組MLT干預(yù)小鼠腫瘤體積均顯著降低（圖2）。

圖2 褪黑素對荷瘤小鼠腫瘤體積影響的統(tǒng)計學(xué)分析。* ，0.01＜P＜0.05；n = 8Fig. 2 Statistical analysis for the effect of melatonin on tumor volume in the cancer-bearing mice. *, 0.01＜ P＜0.05; n = 8

3 褪黑素體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤組織出現(xiàn)自噬形態(tài)

透射電子顯微鏡術(shù)觀察顯示，相比生理鹽水處理的MFC荷瘤小鼠，褪黑素組的腫瘤組織中呈現(xiàn)出增多的自噬泡形態(tài)，胞質(zhì)中可見雙層或多層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡（圖3）。

4 褪黑素干預(yù)后小鼠腫瘤組織中beclin-1和LC3-Ⅱ水平上調(diào)

Western blot檢測顯示，兩組褪黑素干預(yù)組胃癌組織beclin-1和LC3-Ⅱ水平均明顯高于與對照組（圖4），表明褪黑素促腫瘤組織自噬作用。

5 褪黑素抑制小鼠胃癌MFC細胞增殖活性

對細胞形態(tài)觀察顯示，褪黑素單純干預(yù)組和MLT+3-MA聯(lián)合給藥組的MFC細胞的光鏡形態(tài)明顯改變，比正常細胞觸角明顯縮短，胞體變圓，而單獨3-MA給藥組的細胞形態(tài)無明顯改變（圖5AD）。細胞增殖活性CCK-8法檢測顯示，與空白對照組相比，褪黑素單獨干預(yù)組MFC細胞增殖率顯著下降，而單獨3-MA給藥組的細胞增殖率無明顯變化。與MLT單獨給藥組相比，MLT+3-MA聯(lián)合給藥組MFC細胞增殖率進一步顯著下降（圖5E）。

圖3 腫瘤組織透射電鏡觀察。A，對照組。B，褪黑素處理組，可見雙層或多層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡（箭頭）Fig. 3 Transmission electron microscopic observation of tumor tissue. A, control group; B, melatonin-treated group, it showed autophagic vacuoles in double-layer or multi-layer membrane structure (arrow)

圖4 褪黑素對荷胃癌小鼠腫瘤組織中beclin-1和LC3-Ⅱ表達的影響。A，beclin-1和LC3-ⅡWestern blot檢測；B，beclin-1水平統(tǒng)計學(xué)分析；C，LC3-Ⅱ水平統(tǒng)計學(xué)分析;與對照組比較：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n=3Fig. 4 Effect of melatonin on levels of beclin-1 and LC3-II in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice. A, Western blot detection for levels of beclin-1 and LC3-II; B, statistical analysis for level of beclin-1; C, statistical analysis for level of LC3-II; compared with control: *, 0.01＜P＜0.05; **,P＜0.01; n=3

圖5 褪黑素對小鼠前胃癌MFC細胞增殖活性的影響。A，對照組，腫瘤細胞呈正常形態(tài)；B,MLT組,腫瘤細胞觸角縮短,胞體變圓； C，3-MA組，與對照組相比細胞形態(tài)無明顯差別；D，MLT+3-MA聯(lián)合給藥組，細胞觸角縮短，胞體變圓；E，細胞增殖率的統(tǒng)計學(xué)分析(*，0.01＜P＜ 0.05；**，P ＜0.01；n=3)Fig. 5 Effect of melatonin on the proliferation of murine foregastric carcinoma MFC cells. A, control group, tumor cells showed normal morphology;B, MLT group, antennae of tumor cells was shortened and the cell body became rounded; C, 3-MA group, compared with the control group, there was no signi ficant difference in cell morphology; D, in the MLT+3-MA combined administration group, the cell antenna was shortened and the cell body became rounded; E, statistical analysis for cell proliferation rate (*, 0.01＜P＜ 0.05; **, P＜ 0.01; n = 3)

6 褪黑素體外誘導(dǎo)胃癌MFC細胞出現(xiàn)自噬形態(tài)

透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MLT處理組MFC細胞中呈現(xiàn)出增多的自噬形態(tài)，胞質(zhì)中可見雙層或多層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡（圖6）。

圖6 MFC細胞透射電鏡觀察。A，空白對照組（低倍）；B，空白對照組（高倍）；C，褪黑素給藥組（低倍）；D，褪黑素給藥組（高倍），箭頭示自噬泡Fig. 6 Transmission electron microscopic observation of MFC cells. A, blank control group (low magni fication); B, blank control group (high magni fication); C, melatonin group (low magni fication); D, melatonin group (high magni fication), arrow showing autophagic vacuoles

7 褪黑素上調(diào)胃癌細胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ水平

Western blot檢測顯示，與空白對照組相比，褪黑素組MFC細胞beclin-1和LC3-Ⅱ水平明顯上調(diào)，自噬抑制劑3-MA處理組則明顯下調(diào)，而褪黑素與3-MA聯(lián)合用藥組則與對照組的beclin-1和LC3-Ⅱ水平無明顯差異（圖7）。

圖7 褪黑素對胃癌細胞內(nèi)beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白水平的影響。A，beclin-1和LC3-ⅡWestern blot檢測；B，B, beclin-1蛋白表達水平統(tǒng)計學(xué)分析；C，LC3-Ⅱ蛋白表達水平統(tǒng)計學(xué)分析;與對照組比較：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n=3Fig. 7 Effect of melatonin on levels of beclin-1 and LC3-II in gastric cancer cells. A, Western blot detection for protein levels of beclin-1 and LC3-II; B, statistical analysis for level of beclin-1; C, statistical analysis for level of LC3-II ; compared with control: *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01;n=3

討 論

酵母ATG6同源物beclin-1是自噬體形成的第一步，是自噬的重要引發(fā)者之一[11]。酵母ATG8基因的同源物LC3現(xiàn)已作為自噬的特異性標志蛋白［12］，自噬發(fā)生時LC3由胞質(zhì)型（即LC3-I）轉(zhuǎn)位到自噬體膜（LC3-Ⅱ)增加，但LC3-Ⅰ相對不穩(wěn)定，易受環(huán)境及實驗條件等多種因素的影響，因此多數(shù)研究將LC3-Ⅱ作為自噬檢測指標［13-14］。

本實驗成功建立了荷胃癌小鼠模型，褪黑素干預(yù)組小鼠腫瘤體積明顯縮小且CCK-8結(jié)果顯示MLT組細胞增殖率也明顯下降，表明褪黑素在體內(nèi)外均有抑制胃癌細胞增殖作用。同時，褪黑素干預(yù)后，小鼠腫瘤組織和胃癌MFC細胞胞質(zhì)中均出現(xiàn)了多層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡，且細胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ的表達明顯上調(diào)，證實在褪黑素體內(nèi)外抑制胃癌細胞增殖過程中，腫瘤細胞自噬表達增強，與前期研究[15]中胃癌細胞凋亡過程中的自噬水平上調(diào)相一致。

近年來研究發(fā)現(xiàn)[16]，自噬促進胃癌細胞對順鉑(cDDP)的耐藥，而自噬抑制劑氯喹(CQ)顯著增強胃癌細胞對cDDP的化學(xué)敏感性。另有研究表明[17]，姜黃素單獨使用誘導(dǎo)胃癌細胞株BGC-823、SGC-7901和MKN-28產(chǎn)生的保護性自噬，可防止細胞大量凋亡，自噬抑制劑3-MA與姜黃素聯(lián)合使用可顯著促進細胞凋亡，從而增強抗癌作用。

為了探究MLT干預(yù)后腫瘤細胞自噬水平的升高是起著保護還是促進腫瘤細胞死亡的作用，體外實驗通過采用3-MA來阻斷自噬，評估其對于MLT抗腫瘤效果的影響。3-MA是一種廣泛使用的自噬阻斷劑，能阻止自噬體與溶酶體融合而抑制自噬小體的形成［18]。本研究結(jié)果顯示，MLT+3-MA聯(lián)合給藥組胃癌細胞觸角縮短，胞體變圓，且增殖率較MLT組進一步下降，同時，3-MA組的細胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ的表達顯著降低。由此說明3-MA能夠通過抑制細胞自噬從而增強MLT抑制腫瘤增殖的作用，并提示通過抑制細胞保護性自噬可能會增強腫瘤細胞對褪黑素的敏感性。細胞保護性自噬在褪黑素抗胃癌細胞中所起的具體作用及分子機制有待進一步研究闡明。

綜上所述，褪黑素體內(nèi)外干預(yù)后，胃癌細胞增殖抑制且細胞自噬水平上升，可能是腫瘤細胞抵御褪黑素毒性的一種自我保護機制，通過抑制細胞自噬能增強褪黑素的抗腫瘤作用。細胞自噬在褪黑素體內(nèi)外抑制胃癌細胞增殖過程中起自我保護作用。