下一代測序技術(shù)在乳業(yè)中的應(yīng)用

文/林少華 羅紅霞

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院食品與生物工程系）

乳業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈包括上游的奶牛養(yǎng)殖業(yè)和下游的乳制品加工業(yè)。微生物始終影響著乳業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈的各個環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)的微生物分離和鑒定更多的依據(jù)可培養(yǎng)和可視化的方式，但隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，下一代測序技術(shù)，又稱為高通量測序技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS）的出現(xiàn)和成熟，實現(xiàn)了對樣品中所有微生物的DNA或RNA直接測序，進而了解微生物群落的組成、分布及動態(tài)變化[1]。NGS基于細菌16S rRNA基因及真菌rRNA基因間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）可以快速獲取被檢測樣本的基因序列或堿基對信息，不但省去了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法的繁瑣過程，且為大量不可培養(yǎng)微生物的研究提供了方法，因其靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點逐步成為食品微生物研究的常規(guī)途徑之一[2～4]。代表技術(shù)有Illuminag公司的Solexa測序技術(shù)，Roche公司的454焦磷酸技術(shù)，ABI公司的SOLID技術(shù)和Pacific Bioscience公司的SMRT技術(shù)。隨著NGS在乳業(yè)的廣泛應(yīng)用，大大提高了乳業(yè)行業(yè)對微生物的研究進展，其在奶牛養(yǎng)殖和乳制品加工環(huán)節(jié)微生物的多樣性和群落演替分析方面發(fā)揮著越來越重要的作用，如青貯飼料的研究、奶牛乳房炎的防治、干酪等乳制品的制作等。因此，本文主要探討了下一代測序技術(shù)在乳業(yè)的應(yīng)用，以期為乳業(yè)的發(fā)展提供相關(guān)研究線索。

1 在奶牛養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的應(yīng)用

1．1 青貯飼料微生物分析

青貯飼料是奶牛十分重要的口糧，微生物在青貯飼料制作過程中的組成及變化對青貯飼料品質(zhì)的高低具有非常重要的影響。然而，采用費時、費力且有一定片面性的傳統(tǒng)培養(yǎng)法研究青貯飼料中微生物群落的變化具有局限性，無法完全了解微生物的組成、豐度及變化[5]。陶蓮等[6]結(jié)合實驗室檢測手段和下一代測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)玉米秸稈經(jīng)過青貯發(fā)酵后，變形菌門、γ-變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科和魏斯氏菌屬菌群數(shù)量顯著降低，青貯發(fā)酵能夠顯著增加厚壁菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、乳桿菌科、片球菌屬和乳桿菌屬菌群數(shù)量。這些結(jié)果對于分析青貯發(fā)酵前、后玉米秸稈品質(zhì)及菌落構(gòu)成和豐度的變化，進而為發(fā)酵過程的調(diào)控提供了理論依據(jù)。胡宗福等[7]利用宏基因組學技術(shù)，研究和分析了全株玉米青貯發(fā)酵過程中和發(fā)酵后暴露空氣后菌群構(gòu)成及其演替規(guī)律，結(jié)果表明，全株玉米經(jīng)過40 天的青貯發(fā)酵，通過IlluminaMiseq測序平臺共獲得122 371 條高質(zhì)量有效序列，聚類為239 個操作分類單元，經(jīng)分類學鑒定分屬16 個門，163 個屬。在門水平上，厚壁菌門始終占優(yōu)勢。發(fā)酵前期、后期和開袋期優(yōu)勢菌屬均為乳桿菌屬，但在開袋期芽孢乳桿菌屬的比例上升明顯。因此，全株玉米青貯自然發(fā)酵升高了產(chǎn)乳酸乳桿菌屬的豐度，有利于提高全株玉米青貯的發(fā)酵品質(zhì)，但開袋暴露空氣3 天對全株玉米青貯的微生物多樣性產(chǎn)生了影響。這些結(jié)果為全面了解全株玉米自然青貯發(fā)酵過程中微生物組成及變化、發(fā)掘全株玉米附生有益微生物種類、提高青貯飼料營養(yǎng)價值和品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)和新方法。Li等[8]采用下一代測序技術(shù)研究了大量添加微藻的銀草青貯品質(zhì)，并分析了青貯期細菌群落的變化，發(fā)現(xiàn)在青貯發(fā)酵過程中檢測到30 多個菌屬群落結(jié)構(gòu)的變化情況。對于無微藻的樣品，1～3 天主要菌屬為腸球菌屬，之后乳酸桿菌屬成為優(yōu)勢屬；而添加了微藻的樣品中，最常見的是乳酸菌屬。

1．2 奶牛瘤胃微生物分析

反芻動物瘤胃中生活著豐富的微生物群體，它們的數(shù)量和組成對瘤胃的消化吸收、營養(yǎng)代謝、生長性能和免疫功能等方面具有重要影響[9]。因瘤胃處于厭氧狀態(tài)，導致其中的微生物人為培養(yǎng)十分困難，限制了對瘤胃微生物的探索研究。隨著下一代測序技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展，使用該技術(shù)研究反芻動物瘤胃微生物的報道越來越多。李子健等[10]研究了不同生理階段荷斯坦奶牛瘤胃細菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)奶牛從圍產(chǎn)前期進入泌乳期后，瘤胃細菌多樣性顯著降低；而泌乳期各階段瘤胃細菌組成差異較小。圍產(chǎn)前期奶牛瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢菌門為擬桿菌門和厚壁菌門，優(yōu)勢菌科為普雷沃氏菌科；泌乳期奶牛瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢菌門則為擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門，優(yōu)勢菌科為琥珀酸弧菌科和普雷沃氏菌科。日糧中的改變對反芻動物瘤胃微生物組成具有顯著的影響，Pitta等[11]采用下一代測序技術(shù)研究日糧蛋白質(zhì)含量的增加對瘤胃微生物的影響發(fā)現(xiàn)，高日糧蛋白和低日糧蛋白的瘤胃微生物Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)差異顯著，并會促使普雷沃菌屬的豐度升高至最高比例。

1．3 奶牛疾病微生物分析

奶牛很多疾病與病原微生物有關(guān)，如乳房炎，這是影響奶牛健康的主要疾病之一，會導致患病奶牛產(chǎn)奶量降低、原料奶品質(zhì)下降，影響奶牛場的經(jīng)濟效益。研究發(fā)現(xiàn)，細菌、病毒、真菌、支原體等約150 多種病原體可引起奶牛乳房炎[12]，常見的有金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌等[13]。但仍有25%引起臨床乳房炎的微生物未能通過可培養(yǎng)的方式檢測得到[14]，因此，需要使用分子生物學的方法進行微生物群落結(jié)構(gòu)分析。曾學琴等[15]采用下一代測序技術(shù)研究了奶牛乳房炎關(guān)聯(lián)微生物群落的結(jié)構(gòu)及多樣性，發(fā)現(xiàn)乳房炎奶牛的乳頭表面微生物組成與乳房炎奶牛產(chǎn)的牛奶中的微生物組成差異顯著，其中乳頭表面豐度最高的是厚壁菌門，牛奶中則是變形菌門；乳頭表面含有擬桿菌門和梭桿菌門，而牛奶中幾乎沒有；梭桿菌屬僅在乳頭表面上檢測到，而牛奶中假單胞菌屬豐度最高。奶?；既榉垦缀笕轭^表面及產(chǎn)的牛奶中的微生物群落與正常奶牛產(chǎn)的牛奶存在差異，在患乳房炎的奶牛乳頭表面能檢測到梭桿菌門，而正常奶牛則未檢出；患乳房炎的奶牛乳頭表面金黃色釀膿葡萄球菌屬豐度高于正常奶牛，腸球菌屬僅在患乳房炎的奶牛所產(chǎn)牛奶中檢測到，正常奶牛卻未檢出。Catozzi等[16]的研究也表明，患乳房炎的奶水牛所產(chǎn)水牛奶樣品中主要有厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門和放線菌門。

1．4 牛床墊料微生物分析

隨著公眾環(huán)保意識的增強，政府執(zhí)法力度的加大，奶牛場的糞污處理越來越受到重視。除了使用糞污制做沼氣或澆灌之外，制作奶牛臥床墊料也是一種有效的回收利用途徑。墊料制備過程中的微生物群落組成變化受到環(huán)境條件的影響，反過來也會影響墊料本身的質(zhì)量和奶牛的健康。Sun等[17]采用下一代測序技術(shù)探索了細菌和真菌群落在墊料制備不同階段的動態(tài)變化，并對理化參數(shù)、微生物群落組成和豐度之間的關(guān)系進行了評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，墊料中的細菌主要門類有變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門，真菌主要門類為子囊菌門；線性判別分析表明，包括Scedosporiumprolificans在內(nèi)的多種病原菌在墊料制成后第9天的豐度在不斷增加，基于此，提出建議每7天更換一次墊料。

2 在乳制品加工方面的應(yīng)用

2．1 原料乳微生物分析

原料乳是進行乳制品加工的基礎(chǔ)，其質(zhì)量好壞直接影響乳制品的品質(zhì)。因此，對原料乳進行微生物尤其是致病菌的檢測，保障原料乳質(zhì)量安全，降低奶牛養(yǎng)殖的風險，從源頭上杜絕致病菌的危害非常重要。原料乳的品質(zhì)受儲藏條件、溫度和時間等因素影響。姚宇秀等[18]利用IlluminaMiSeq下一代測序技術(shù)測定原料乳及其環(huán)境中微生物多樣性和致病菌的豐度情況發(fā)現(xiàn)，輸乳管路外側(cè)和盛裝原料乳的空貯罐中均檢測出金黃色葡萄球菌等致病菌，會對原料乳產(chǎn)生污染，因此，要從源頭上健全養(yǎng)殖環(huán)境與管理機制。張敏等[19]研究表明，原料乳的菌群以變形菌門為主。在冷藏過程中，Doyle等[20]研究發(fā)現(xiàn)，2～6 ℃的貯藏溫度下，0～96 h對原料乳中微生物的變化影響小，而泌乳階段對原料乳中微生物豐度的變化影響更大。

2．2 巴氏殺菌乳微生物分析

巴氏殺菌乳是一種低溫殺菌產(chǎn)品，因處理方法溫和，不能殺滅原料乳中所有的微生物[21]。其貨架期的判斷若單純依靠可培養(yǎng)技術(shù)來判斷，會因技術(shù)問題而被忽略，導致巴氏殺菌乳的貯藏條件和貨架期等參數(shù)不準確，因為這種檢測技術(shù)僅能獲得實際檢測樣本中不到1．00%的微生物[22]。Quigley等[23]通過使用下一代測序技術(shù)，首次在巴氏殺菌乳樣本中鑒定出了類桿菌、糞便桿菌、普雷沃菌和鏈球菌。該結(jié)果分析表明，巴氏殺菌乳中的細菌種群比以前所認識的更加多樣，且這些種群中的非熱致病菌很可能以一種受損的、不可培養(yǎng)的形式存在，可能對巴氏殺菌乳的質(zhì)量和保質(zhì)期均有潛在影響。丁瑞雪等[24]采用下一代測序技術(shù)分析了巴氏殺菌乳在0 ℃、4℃、10 ℃條件下分別貯藏0 天、3 天、6 天、9 天、12 天和15天內(nèi)微生物的群落組成及動態(tài)變化。結(jié)果表明，不同貯藏溫度條件下巴氏殺菌乳中微生物的組成及多樣性在門和屬水平上差異顯著。在0 ℃下貯藏15 天內(nèi)的巴氏殺菌乳微生物多樣性保持最完整，而在4 ℃、10 ℃貯藏期間巴氏殺菌乳的菌群構(gòu)成及優(yōu)勢菌群都發(fā)生了變化，主要菌群變?yōu)榧賳伟鷮俸蜌鈫捂呔鷮俚?。? ℃下貯藏9 天、10 ℃下貯藏6 天都出現(xiàn)了類芽孢菌屬、沙雷氏菌屬，初步推測這兩種菌屬是導致巴氏殺菌乳品質(zhì)變化的關(guān)鍵因素。

2．3 UHT乳微生物分析

為了延長牛奶的保質(zhì)期，常采用超高溫瞬時滅菌（Ultra High Temperature treated，UHT）的熱處理技術(shù)對牛奶中的微生物和芽孢進行完全的破壞，使其無法在常溫中生長繁殖。理論上，UHT乳應(yīng)該是處于無菌狀態(tài)，然而市場上出現(xiàn)的壞包、脹包等現(xiàn)象表明UHT乳也可能存在微生物。因傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)分離方法和早期的分子生物學技術(shù)對UHT乳中微生物的研究不能客觀反映其狀態(tài)，黃衛(wèi)強等[25]以宏基因組DNA 16SrRNA基因V1-V3可變區(qū)的下一代測序技術(shù)，研究了國內(nèi)兩個不同品牌UHT乳樣品中微生物多樣性，結(jié)果表明，兩份UHT乳中的微生物主要有厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門四個菌門，該研究側(cè)面反映出下一代測序技術(shù)在UHT乳中微生物多樣性檢測方面的優(yōu)勢。

2．4 酸奶微生物分析

“開菲爾”酸奶是許多國家和地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，是一種復合型發(fā)酵酸乳。接種的開菲爾粒是一種天然混菌發(fā)酵體系，為乳白色、膠質(zhì)狀顆粒。對于開菲爾菌相的研究可以追溯到19世紀末，只有了解其菌相組成才能探討其發(fā)酵過程、代謝機制等問題，從而確保發(fā)酵乳的安全性，實現(xiàn)商業(yè)化。高潔等[26]采用宏基因組學技術(shù)提取開菲爾粒中的總DNA，通過下一代測序技術(shù)和生物信息學分析方法得出，乳酸菌和醋酸菌是開菲爾粒中的優(yōu)勢菌相，占細菌總數(shù)的90．00%；而其余5 個菌屬，包括鏈球菌屬、希瓦氏菌屬、明串珠菌屬、假單胞菌屬和不動桿菌屬，占細菌總數(shù)的10．00%左右。Nalbantoglu等[27]采用下一代測序技術(shù)對兩種土耳其開菲爾粒中的微生物多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)它們的微生物菌落具有高度一致性，乳酸菌屬是豐度最高菌屬，分別為99．42%和99．79%，該屬主要由開菲爾基質(zhì)乳桿菌、布氏乳桿菌和瑞士乳桿菌三種乳酸菌構(gòu)成，總豐度分別占該乳酸菌屬的97．63%和98．74%。智楠楠等[28]采用下一代測序技術(shù)對9種市售酸奶中的微生物多樣性進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品的豐度以厚壁菌門為主占99．60%，其中，鏈球菌屬占87．10%、乳桿菌屬占10．30%、乳球菌屬占0．30%。

2．5 干酪微生物分析

干酪的制作與微生物有密切的關(guān)系，研究其細菌、真菌和霉菌的變化對深入研究干酪質(zhì)地和風味的形成具有重要的意義[29]。Wolfe等[30]對10 個國家的137 種奶酪表皮微生物群落進行了宏基因組測序，發(fā)現(xiàn)了24 種主要的細菌和真菌。Aldrete-Tapia等[31]采用下一代測序技術(shù)對意大利Plaisentif半硬質(zhì)干酪的生產(chǎn)進行了跟蹤研究發(fā)現(xiàn)，在干酪的生乳期和凝乳期細菌多樣性較高，變形菌門和厚壁菌門的豐度最高；在干酪成熟前期和成熟后期微生物多樣性降低，主要有厚壁菌門中的乳酸菌屬和鏈球菌屬，多為乳酸菌。傳統(tǒng)奶酪發(fā)酵是由微生物群落共同作用的結(jié)果，然而，目前對這些微生物群落的結(jié)構(gòu)、安全性及相互作用等特征的研究仍需要進一步加強。Almeida等[32]采用下一代測序技術(shù)建立了奶酪菌群數(shù)據(jù)庫，對其67 個屬中137 個物種的142 株菌株進行了基因組測序，包括克呂沃氏菌屬，藤黃球菌屬和海生乳桿菌屬等，這對干酪微生物的群落研究及干酪產(chǎn)品的風味特性研究起到了重要作用。呼斯楞[33]采用宏基因組學研究方法分析了哈薩克斯坦阿拉木圖市和江布爾州兩個地區(qū)采集的6 份自然發(fā)酵制成的傳統(tǒng)干酪，發(fā)現(xiàn)該傳統(tǒng)干酪中的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，豐度為92．46%，優(yōu)勢菌屬為乳酸桿菌屬，豐度為42．12%，優(yōu)勢菌種分別為乳酸乳桿菌（豐度為28．93%）和瑞士乳桿菌（豐度為26．43%）。

2．6 嬰幼兒配方奶粉微生物分析

嬰幼兒配方奶粉是嬰幼兒除母乳外最重要的食品，其安全的重要性不容置疑，因此，對這類產(chǎn)品開展質(zhì)量安全等關(guān)鍵性指標的研究十分必要[34]。王鳴秋等[35]采用下一代測序技術(shù)對14 個嬰幼兒食品樣本中細菌16S rRNA的V4-V5可變區(qū)進行了測序，分析結(jié)果表明，羊奶粉樣品中占絕對優(yōu)勢菌群隸屬于厚壁菌門（豐度為65．58%）和變形菌門（豐度為16．01%），在屬水平上以鏈球菌屬（豐度為24．86%）和乳球菌屬（豐度為21．44%）為主，為探究嬰幼兒奶粉生產(chǎn)的質(zhì)量控制和監(jiān)管提供了理論依據(jù)。

3 其他與乳相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用

以動物乳、乳清或乳清粉等為主要原料，經(jīng)發(fā)酵等工藝釀制而成的奶酒，受到發(fā)酵菌株的篩選等方面因素的制約[36，37]，影響著奶酒的工業(yè)化生產(chǎn)。林少華等[38]采用下一代測序技術(shù)，對奶酒的真菌生物多樣性進行了檢測，結(jié)果表明，酵母菌屬（Saccharomyces）和曲霉屬（Aspergillus）是奶酒主要真菌群落，其中，酵母菌屬的豐度約為62．00%，曲霉屬的豐度為33．00%。烏日汗等[39]應(yīng)用IlluminaMiSeq第2代測序技術(shù)測定了內(nèi)蒙古科爾沁地區(qū)食療用酸馬奶發(fā)酵引子的細菌多樣性。發(fā)現(xiàn)該樣品主要包括乳桿菌屬（豐度為84．08%）、醋桿菌屬（豐度為9．83%）、乳球菌屬（豐度為2．41%）和鏈球菌屬（豐度為2．18%）。

4 展望

隨著下一代測序技術(shù)及生物信息學技術(shù)的發(fā)展，宏基因組學將會越來越多的被用于研究乳業(yè)中微生物群落結(jié)構(gòu)及其演替規(guī)律，以及挖掘傳統(tǒng)培養(yǎng)方法無法獲得的微生物信息等基礎(chǔ)研究。雖然下一代測序的出現(xiàn)為乳業(yè)研究微生物提供了一個嶄新的平臺和廣闊的前景，然而面臨的挑戰(zhàn)仍然存在，局限性仍不容忽視。如該技術(shù)依賴的總DNA提取受復雜多樣的環(huán)境影響；現(xiàn)有的測序技術(shù)序列片段短，拼接具有一定難度；宏基因組測序數(shù)據(jù)量較大，后續(xù)數(shù)據(jù)的分析因算法程序的差異而有較大的變化；測序費用昂貴導致測序重復樣本較少，降低了實驗結(jié)果的再現(xiàn)性等。未來，隨著更具優(yōu)勢的三代測序技術(shù)應(yīng)運而生，將為微生物群落結(jié)構(gòu)的研究提供了更加準確可靠的方法。此外，日益豐富和完善的微生物基因組數(shù)據(jù)庫將有利于提高宏基因組數(shù)據(jù)拼接和注釋的效率。宏基因組學、宏轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學的綜合運用將有助于更深刻地了解微生物的群落結(jié)構(gòu)演替、相互作用以及對青貯飼料的制作、奶牛疾病的防控、營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控和乳制品的優(yōu)化和開發(fā)等的應(yīng)用。C