沙棘果油納米乳液的性質(zhì)與抗氧化活性研究

蔣忠榮，張 濤，王 濤，常 明，劉睿杰，金青哲，王興國(guó)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇 無(wú)錫 214122)

沙棘作為一種藥食同源的植物，從1977年就被衛(wèi)生部列入《中國(guó)藥典》，而沙棘果油作為沙棘果實(shí)的精華，是沙棘中最有價(jià)值的成分之一。沙棘果油主要有兩種來(lái)源，由沙棘鮮果或果漿通過水酶法或離心分離的方法獲得沙棘果油[1]，或由沙棘干果通過超臨界、亞臨界或溶劑提取等方式制得沙棘果油，也稱沙棘全果油[2]。沙棘果油作為一種功能性油脂，具有獨(dú)特的脂肪酸組成，不僅富含油酸和亞油酸，其棕櫚油酸含量明顯高于一般植物油。此外，沙棘果油中還含有豐富的生育酚、植物甾醇、類胡蘿卜素、黃酮等脂質(zhì)伴隨物，具有優(yōu)異的抗氧化效果，具有開發(fā)為營(yíng)養(yǎng)功能豐富的脂肪乳飲料的潛在價(jià)值。但沙棘果油及其中的多種有益伴隨物均為脂溶性物質(zhì)，限制了其在飲料等水相中的應(yīng)用。

近年來(lái)，食品級(jí)納米乳液作為一種簡(jiǎn)單有效的包埋運(yùn)輸體系，已被廣泛應(yīng)用于功能性油脂和各種油溶性營(yíng)養(yǎng)素的包埋與傳遞，能夠防止功能營(yíng)養(yǎng)成分被氧化，并提高其水溶性和生物利用率[3]。納米乳液與普通乳液最大的區(qū)別還在于其在儲(chǔ)存過程中可以抵抗絮凝、聚結(jié)以及重力分離，是一種“近熱力學(xué)穩(wěn)定”體系[4]。另外，利用乳液包埋技術(shù)可以在一定程度上降低沙棘果油的固有風(fēng)味，使其更容易被消費(fèi)者所接受。納米乳液的制備方法包括高能法和低能法[3]，高壓均質(zhì)乳化技術(shù)作為常用的高能法制備納米乳液技術(shù)，具有乳液粒徑小、分布均勻、乳液體系穩(wěn)定、表面活性劑的需求量小等優(yōu)勢(shì)[5]。目前，利用高壓均質(zhì)乳化技術(shù)制備納米乳液，已有關(guān)于紅麻籽油納米乳液[6]、姜油納米乳液[7]、魚油納米乳液[8]、肉桂精油納米乳液[9]、β-胡蘿卜素納米乳液[10]等的研究，但是還未見對(duì)沙棘果油納米乳液的研究。

本文以酪蛋白酸鈉作為乳化劑，采用高壓均質(zhì)的方法制備沙棘果油納米乳液。分析5種沙棘果油樣品的脂肪酸和主要脂質(zhì)伴隨物組成，并對(duì)制得的沙棘果油納米乳液特性及穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性、細(xì)胞抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為沙棘果油脂肪乳產(chǎn)品及相關(guān)保健品開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

5種沙棘果油樣品來(lái)源于5家合作企業(yè)的工廠(1、2、3號(hào)產(chǎn)地分別為黑龍江、甘肅、新疆，4、5號(hào)產(chǎn)地為青海)，生產(chǎn)過程未添加抗氧化劑，-20℃冰箱避光保存。酪蛋白酸鈉，購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；2′,7′-二氯熒光二乙酸鹽(DCFH-DA)、2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(ABAP)，均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；正己烷、異丙醇、甲醇和二氯甲烷為色譜純，其他試劑為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Ultra-Turrax T25高速分散機(jī)、HPH2000/4-SH5超高壓均質(zhì)機(jī)，德國(guó)Ika儀器設(shè)備有限公司；Nano Brook Omni多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀，美國(guó)Brookhaven儀器公司；MS-S標(biāo)準(zhǔn)型磁力攪拌器；Fluoroskan Ascent FL熒光酶標(biāo)儀、Trace GC MLtra氣相色譜儀、ISQ質(zhì)譜檢測(cè)儀，美國(guó)Thermo公司；7820氣相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Waters1525高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沙棘果油脂肪酸組成分析

稱取0.05 g油樣溶于2 mL正己烷，加入500 μL 2 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，旋渦振蕩混勻，離心，取上層有機(jī)相，加入適量無(wú)水硫酸鈉，過膜后進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。氣相色譜條件參考文獻(xiàn)[11]。

1.2.2 生育酚含量測(cè)定

稱取1.0 g油樣，在10 mL棕色容量瓶中用正己烷溶解定容后過膜,按參考文獻(xiàn)[12]測(cè)定生育酚含量。

1.2.3 植物甾醇含量測(cè)定

采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)測(cè)定沙棘果油中植物甾醇含量[13]。

1.2.4β-胡蘿卜素含量測(cè)定

采用反相高效液相色譜法測(cè)定β-胡蘿卜素含量，樣品前處理方式參照劉慧敏[11]的方法。反相高效液相色譜條件：檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，流動(dòng)相為甲醇-二氯甲烷(體積比7∶3)，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.5 沙棘果油納米乳液的制備

沙棘果油納米乳液的制備方法在易江[14]方法的基礎(chǔ)上稍加修改。以酪蛋白酸鈉為乳化劑，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的水溶液，磁力攪拌器室溫下攪拌過夜，使其充分水化。將蛋白質(zhì)水溶液和5種不同來(lái)源的沙棘果油按照質(zhì)量比9∶1混合，用高速分散機(jī)在20 000 r/min下剪切4 min，剪切30 s停30 s，制成粗乳液。然后用超高壓均質(zhì)機(jī)在均質(zhì)壓力100 MPa、循環(huán)次數(shù)4次的條件下制備沙棘果油納米乳液，采用冰水浴降溫。在制備過程中，所有容器均使用錫箔紙包裹，以保證沙棘果油中脂質(zhì)伴隨物在制備過程中盡可能少的損失。

1.2.6 沙棘果油納米乳液特性表征

用Nano Brook Omni多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀測(cè)定沙棘果油納米乳液的平均粒徑、多分散系數(shù)(PDI)以及Zeta電位，測(cè)量角度選取90°，粒徑范圍選取50～250 nm，沙棘果油油滴的折射率設(shè)置為1.45，水相折射率為1.33。為降低多重光散射效應(yīng)，測(cè)定前用超純水將沙棘果油納米乳液稀釋100倍。

1.2.7 沙棘果油納米乳液離心穩(wěn)定性的測(cè)定

在Xu等[5]方法的基礎(chǔ)上稍加修改測(cè)定沙棘果油納米乳液離心穩(wěn)定性。取100 μL沙棘果油納米乳液樣品用超純水稀釋100倍，在2 000g下離心20 min，小心吸取等量離心前后相同位置下層樣品旋渦振蕩后，在500 nm下測(cè)定吸光度。按照下式計(jì)算表征離心穩(wěn)定性的Ke值。

1.2.8 沙棘果油納米乳液細(xì)胞毒性的測(cè)定

參照Wolfe[15]、王立峰[16]等的方法研究沙棘果油納米乳液的細(xì)胞毒性作用。接種量調(diào)整為2×104個(gè)/孔，去離子水清洗次數(shù)6次及以上，至無(wú)浮色。以不加沙棘果油納米乳液樣品的培養(yǎng)基作為對(duì)照，沙棘果油納米乳液的半數(shù)抑制濃度(IC50)通過質(zhì)量濃度-細(xì)胞存活率曲線擬合計(jì)算得到。

1.2.9 沙棘果油納米乳液的細(xì)胞抗氧化活性評(píng)價(jià)

參照Wolfe等[15]建立的細(xì)胞抗氧化活性評(píng)價(jià)模型和張志艷[17]的細(xì)胞抗氧化活性測(cè)定方法。接種量調(diào)整為3×104個(gè)/孔，對(duì)照組無(wú)沙棘果油納米乳液樣品處理，空白組無(wú)沙棘果油納米乳液樣品處理并在棄去磷酸鹽緩沖液(PBS)后添加不含ABAP的Hank平衡鹽溶液(HBSS)。對(duì)每個(gè)樣品繪制時(shí)間-熒光值曲線并進(jìn)行積分，表征細(xì)胞抗氧化活性的CAA值通過下式進(jìn)行計(jì)算。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析

每次實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)兩次，求平均值，利用Origin 2018數(shù)據(jù)處理軟件作圖并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 沙棘果油的主要組成

2.1.1 脂肪酸組成

5種沙棘果油樣品脂肪酸組成及相對(duì)含量如表1所示。

表1 沙棘果油的脂肪酸組成及相對(duì)含量 %

由表1可知，5種沙棘果油樣品的主要脂肪酸包括不飽和脂肪酸如棕櫚油酸(32.23%～35.24%)、油酸(20.33%～22.86%)、亞油酸(7.16%～8.19%)和亞麻酸(2.52%～3.05%)，以及飽和脂肪酸如棕櫚酸(28.92%～32.52%)和硬脂酸(1.53%～2.77%)，總體脂肪酸含量差異不大。單不飽和脂肪酸占54.97%～56.56%，其中棕櫚油酸含量高達(dá)32.23%～35.24%，這是沙棘果油脂肪酸組成區(qū)別于一般植物油的特點(diǎn)。棕櫚油酸是一種n-7單不飽和脂肪酸，主要存在于魚油或海洋浮游生物中，在一般油料作物中含量較少，目前由于其具有改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)糖脂代謝的生理功能備受關(guān)注。

2.1.2 脂質(zhì)伴隨物

沙棘果油含有豐富的有益脂質(zhì)伴隨物，5種沙棘果油樣品生育酚、植物甾醇、β-胡蘿卜素組成及含量如表2所示。

表2 沙棘果油脂質(zhì)伴隨物組成和含量 mg/kg

由表2可知，5種沙棘果油樣品的生育酚總量在188.28～244.18 mg/kg的范圍內(nèi)波動(dòng)，其中85%以上為α-生育酚，而β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚含量很少。植物甾醇中β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇總量在6 994.34～11 091.26 mg/kg之間，4號(hào)沙棘果油3種甾醇總量(11 091.26 mg/kg)和β-谷甾醇含量(10 736.08 mg/kg)明顯優(yōu)于另外4種樣品。5種沙棘果油樣品中β-胡蘿卜素含量(183.25～241.25 mg/kg)均較高，這是沙棘果油呈現(xiàn)黃色或橙紅色的主要原因。

2.2 沙棘果油納米乳液的特性表征(見表3)

從表3可以看出，經(jīng)過高壓均質(zhì)后，5種沙棘果油納米乳液平均粒徑范圍在156.3～173.4 nm之間，相比經(jīng)過剪切預(yù)乳化的粗乳液粒徑(大于1 200 nm)有明顯的減小，均達(dá)到納米級(jí)別(小于200 nm)。5種沙棘果油納米乳液的PDI小于0.3，說明沙棘果油納米乳液均勻程度良好[18]。在相同的乳化劑比例和均質(zhì)條件下，不同來(lái)源的沙棘果油制得的乳液平均粒徑和PDI等乳液性質(zhì)存在一定的差異，可能是由于油相中脂肪酸以及脂質(zhì)伴隨物組成不同，導(dǎo)致乳化劑與油相的分布出現(xiàn)差異，進(jìn)而使乳液特性產(chǎn)生差異。Zeta電位分析的數(shù)據(jù)表明沙棘果油乳滴顆粒帶負(fù)電且絕對(duì)值較大，這是由于酪蛋白酸鈉在該水相體系中帶負(fù)電，形成水包油型納米乳液顆粒的過程中酪蛋白酸鈉會(huì)包裹覆蓋于油滴表面形成球狀，使乳液顆粒帶負(fù)電，電荷絕對(duì)值越大說明體系越穩(wěn)定[19]。5種沙棘果油納米乳液Ke小于15%，具有較強(qiáng)的離心穩(wěn)定性。

表3 5種沙棘果油納米乳液的特性表征

2.3 沙棘果油納米乳液的細(xì)胞毒性

圖1為采用1號(hào)沙棘果油納米乳液樣品，以質(zhì)量濃度分別為10、40、80、160、320、960、1 280、1 920、2 560、3 200 μg/mL的沙棘果油納米乳液作用HepG2細(xì)胞24 h，然后檢測(cè)細(xì)胞存活數(shù)量，以細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，沙棘果油納米乳液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)制作的曲線。由圖1可以看出，樣品1作用HepG2細(xì)胞24 h后，隨著沙棘果油納米乳液質(zhì)量濃度的升高，HepG2細(xì)胞存活率下降，通過擬合計(jì)算得到沙棘果油納米乳液對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50為1 443 μg/mL。

圖2為100 μg/mL的5種沙棘果油納米乳液的細(xì)胞存活率。由圖2可知，在5種沙棘果油納米乳液的質(zhì)量濃度均為100 μg/mL時(shí)，處理HepG2細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率能夠達(dá)到90%以上，細(xì)胞毒性小于等于10%，可視為無(wú)細(xì)胞毒性。

圖1 樣品1的質(zhì)量濃度-細(xì)胞存活率曲線

圖2 5種沙棘果油納米乳液(100 μg/mL)的細(xì)胞存活率

2.4 細(xì)胞抗氧化活性標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3、圖4)

圖3 不同濃度槲皮素的細(xì)胞毒性及時(shí)間-熒光值曲線

圖4 不同濃度槲皮素的CAA值

由圖3可以看出，槲皮素在0～16 μmol/L濃度范圍內(nèi)處理HepG2細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率均在90%以上，表明無(wú)細(xì)胞毒性。進(jìn)一步考察不同濃度槲皮素處理后，加入自由基引發(fā)劑ABAP后1 h內(nèi)熒光值隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)曲線，結(jié)果表明，槲皮素濃度越大，同一時(shí)刻酶標(biāo)儀檢測(cè)出的熒光值越小，對(duì)自由基引發(fā)劑誘發(fā)熒光的過程抑制效果越明顯[15]。對(duì)每一條曲線進(jìn)行積分，通過公式計(jì)算得到濃度范圍為0～16 μmol/L的槲皮素所對(duì)應(yīng)的CAA值(見圖4)，并得到回歸方程y=18.947lnx+0.783 9(R2=0.953 7)。CAA值越大，表征抗氧化物質(zhì)的細(xì)胞抗氧化活性越強(qiáng)，并可以通過擬合的回歸方程對(duì)抗氧化物質(zhì)的細(xì)胞抗氧化活性進(jìn)行定量。

2.5 沙棘果油納米乳液的細(xì)胞抗氧化活性

根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取100 μg/mL的5種沙棘果油納米乳液和100 μg/mL的橄欖油納米乳液(GL)進(jìn)行細(xì)胞抗氧化活性評(píng)價(jià)，結(jié)果見圖5。

圖5 以槲皮素定量的沙棘果油納米乳液及橄欖油納米乳液的CAA值

由圖5可知，5種沙棘果油納米乳液的CAA值分別為(171.88±11.43)、(307.71±22.19)、(238.03±10.30)、(255.24±10.83)、(310.54±21.35)μmolQE/g，橄欖油納米乳液的CAA值為(222.89±13.43)μmolQE/g。結(jié)果表明：除1號(hào)樣品外，沙棘果油納米乳液均表現(xiàn)出更好的細(xì)胞抗氧化活性。同時(shí)，2號(hào)和5號(hào)樣品的細(xì)胞抗氧化活性最強(qiáng)，1號(hào)樣品的細(xì)胞抗氧化活性最弱，可能與1號(hào)樣品的脂質(zhì)伴隨物含量較少有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

以食品級(jí)的酪蛋白酸鈉作為乳化劑，采用高壓均質(zhì)的方法制備沙棘果油納米乳液并對(duì)其相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：沙棘果油主要脂肪酸包括棕櫚油酸、棕櫚酸、油酸和亞油酸，其中棕櫚油酸含量高達(dá)32.23%～35.24%，與一般植物油有明顯區(qū)別；總生育酚含量為188.28～244.18 mg/kg，植物甾醇含量為6 994.34～11 091.26 mg/kg，β-胡蘿卜素含量為183.25～241.25 mg/kg；制得沙棘果油納米乳液平均粒徑范圍在156.3～173.4 nm，PDI小于0.3，Zeta電位的范圍在-50.51～-57.95 mV，Ke小于15%，乳液體系均勻，穩(wěn)定性良好。

在高質(zhì)量濃度情況下沙棘果油納米乳液對(duì)HepG2細(xì)胞具有一定的抑制作用，IC50為1 443 μg/mL，并且100 μg/mL的5種沙棘果油納米乳液的CAA值分別為171.88、307.71、238.03、255.24、310.54 μmolQE/g，除1號(hào)樣品外，均優(yōu)于相同質(zhì)量濃度的橄欖油納米乳液(CAA值為222.89 μmolQE/g)，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞抗氧化活性。