孕婦外周血無創(chuàng)產(chǎn)前檢測失敗的原因分析及妊娠追蹤

盧婉 劉艷秋 黃婷 黃婷婷 周吉會 陽彥

江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心（南昌330006）

近年來，隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，基于孕婦外周血中的胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（non-invasive prenatal testing，NIPT）技術(shù)因高特異性、高敏感性、無創(chuàng)傷的特點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前篩查。NIPT通過采集孕婦外周血，對其血漿中的游離DNA片段（包括cffDNA）進(jìn)行測序，結(jié)合生物信息分析，計(jì)算胎兒患染色體非整倍體的風(fēng)險(xiǎn)，其對21-三體、18三體和13三體的綜合檢出率已高達(dá)98%［1-2］，已成為產(chǎn)前篩查與診斷的重要手段。

然而在實(shí)際工作中，NIPT檢測失敗仍是不能被忽視的一個問題。除去實(shí)驗(yàn)環(huán)境、操作技術(shù)等外在因素，NIPT檢測的成功與否更多的是依賴于母體外周血中cffDNA的濃度。若母血中cffDNA濃度未達(dá)到最低要求4%，則相對高濃度的正常母體DNA會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，此時通常要求孕婦重新采血再次檢測。若重采血的cffDNA濃度仍未達(dá)到要求，則視為NIPT檢測失敗。NIPT的失敗極可能延誤非整倍體疾病的診斷，給孕婦帶來巨大的困擾。有研究［3-4］表明，cffDNA的濃度受孕婦孕周數(shù)、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、妊娠期并發(fā)癥及胎兒染色體核型等多因素的影響，因此探討NIPT失敗原因及引起cffDNA低濃度的因素對協(xié)助產(chǎn)前診斷、制定個體化的產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測方案，具有重要的臨床意義。據(jù)文獻(xiàn)［5-9］報(bào)道，NIPT的失敗率約在1%～2%之間，而國內(nèi)對NIPT的報(bào)道大多集中在其高敏感性及陽性預(yù)測值上，缺乏失敗率的統(tǒng)計(jì)。為了解江西地區(qū)NIPT的整體數(shù)據(jù)，本文對2017年1月至2018年12月的23 704例孕婦進(jìn)行回顧性分析，針對NIPT未獲得有效結(jié)果的孕婦進(jìn)行妊娠隨訪，統(tǒng)計(jì)NIPT的失敗率，總結(jié)并分析其失敗的原因，希望有助于進(jìn)一步完善NIPT技術(shù)規(guī)范。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2017年1月至2018年12月于江西省婦幼保健院就診，經(jīng)知情同意后進(jìn)行NIPT檢測的孕婦23 704例。孕婦年齡18～43歲，孕齡13～28周，對于大于22+6孕周的孕婦在簽署同意書的情況下進(jìn)行。納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)均參照國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會《孕婦外周血游離胎兒DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》［8］。納入標(biāo)準(zhǔn)：血清學(xué)篩查風(fēng)險(xiǎn)值介于高風(fēng)險(xiǎn)與切割值1/1 000之間、介入性產(chǎn)前診斷禁忌癥以及錯過血清學(xué)篩查最價時間要求自愿檢測的孕婦。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕周＜12周、夫妻雙方一方有明確染色體異常、近期接受過異體輸血或免疫治療等外源性DNA介入、超聲結(jié)構(gòu)異常提示需行產(chǎn)前診斷、有基因遺傳病家族史、孕期合并惡性腫瘤。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測序法）、定量試劑QubitTMdsDNA Assay Kit（Invitrogen）、定量試劑 QubitTMssDNA Assay Kit（Invitrogen）。全自動制備系統(tǒng)BGISP-300（MGI）、全自動樣本加載系統(tǒng)BGIDL-50（MGI）、基因測序儀 BGISEQ-500（MGI）、PCR儀（ABI VERITI）。

1.2.2 標(biāo)本采集游離DNA保存管（Geneseek）采集孕婦靜脈血10 mL，96 h內(nèi)分離血漿，避免溶血、脂血及標(biāo)本污染。分離流程：4℃1 600g離心10 min分離血漿取上清，4℃16 000g離心10 min去除管底紅細(xì)胞，分離上清至3只EP管中，每管至少500 μL。血漿于-20℃暫存（保存1周），-80℃保存3年。

1.2.3 孕婦外周血胎兒游離DNA的提取、建庫、測序嚴(yán)格按照核酸提取試劑盒說明書提取胎兒游離DNA，cffDNA經(jīng)末端修復(fù)和連接反應(yīng)得到連有接頭標(biāo)簽的雙鏈DNA分子，再經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到DNA文庫；每個DNA文庫按等質(zhì)量進(jìn)行pooling，最終得到一份3.5 ng/μL的pooling產(chǎn)物。選用胎兒染色體非整倍體試劑盒（T21，T18，T13）試劑盒以高通量測序儀BGISEQ-500檢測，采用光學(xué)拍照的方式對激發(fā)熒光信號的堿基進(jìn)行光學(xué)捕獲，得到相應(yīng)的堿基序列，即測序結(jié)果。將每條DNA片段測序所得的序列與人類基因組進(jìn)行比對，通過生物信息學(xué)分析，計(jì)算胎兒患性染色體非整倍體疾病的風(fēng)險(xiǎn)值。

1.2.4 NIPT結(jié)果處理依據(jù)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理，將測序結(jié)果與人類基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)比對，利用NGS技術(shù)進(jìn)行信息分析，判定21、18、13號染色體的數(shù)量。提示“灰區(qū)”和質(zhì)控不通過的樣本，利用原標(biāo)本重新檢測；胎兒濃度低以及兩次建庫均提示灰區(qū)的樣本，經(jīng)知情同意后需重取樣進(jìn)行檢測。兩次取樣檢測仍未取得有效結(jié)果的，電話告知孕婦并建議其進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

1.2.5 羊膜腔穿刺與核型分析對孕16～24周孕婦行羊膜腔穿刺抽取羊水20 mL，經(jīng)培養(yǎng)后按常規(guī)方法制片，G顯帶，分辨率為320～400條帶［8］。使用萊卡染色體核型掃描分析系統(tǒng)，計(jì)數(shù)30個核型，至少分析5個核型，嵌合體病例計(jì)數(shù)至少50個核型。按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN2016）的標(biāo)準(zhǔn)命名核型。

1.3 妊娠隨訪于2019年6月對孕產(chǎn)婦進(jìn)行電話隨訪，詳細(xì)記錄孕婦產(chǎn)前診斷結(jié)果，孕期并發(fā)癥以及新生兒身體狀況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NIPT檢測結(jié)果23 704例樣本中需重取樣154例，單次采血失敗率為0.65%。其中因游離胎兒DNA濃度低需重取樣共計(jì)88例，兩次建庫Z值處于“灰區(qū)”61例，因GC孤立等質(zhì)控因素重取樣5例。7名孕婦因個人原因拒絕重取樣，3例胎兒丟失，實(shí)際重取樣144例，111例獲得有效NIPT結(jié)果，總失敗率為0.14%（33/23 704）。失敗的33例樣本中，24例cffDNA濃度仍然低于檢測范圍，8例仍處于“灰區(qū)”，1例未知原因?qū)е露鄺l染色體離群，均電話告知孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

2.2 首次需重新取樣的154例樣本信息在154例需要重新取樣的病例中，cffDNA濃度低及Z值處于“灰區(qū)”是兩個主要的原因，占比分別是57.1%（88/154）和39.6%（61/154）。在88例胎兒濃度低的樣本中，雙胎妊娠12例，BMI＞25的15例，有妊娠期并發(fā)癥的5例，檢測前有肝素治療的3例。在61例Z值處于“灰區(qū)”的樣本中，雙胎妊娠6例，BMI＞25的10例，有妊娠期并發(fā)癥的8例，檢測前有肝素治療的7例（表1）。

表1 需重新取樣的154例樣本的臨床資料Tab.1 Clinical data of 154 patients requiring re-sampling ±s

表1 需重新取樣的154例樣本的臨床資料Tab.1 Clinical data of 154 patients requiring re-sampling ±s

原因分布cffDNA濃度低Z值處于“灰區(qū)”Z13“灰區(qū)”Z18“灰區(qū)”Z21“灰區(qū)”Z13.21“灰區(qū)”質(zhì)控因素總計(jì)例數(shù)88 61 8 21 31 BMI（kg/m2）23.80±3.54孕周數(shù)（周）16.31±1.22備注雙胎妊娠12例；BMI＞25 15例；妊娠并發(fā)癥5例；肝素治療3例23.31±2.90 16.65±1.67雙胎妊娠6例；BMI＞25 10例；妊娠并發(fā)癥8例；肝素治療7例1 5/154占比（%）57.14 39.61 5.19 13.63 20.13 0.64 3.25 100 16.34±0.84 16.46±1.57 23.36±2.61 23.74±3.67雙胎妊娠18例；BMI＞25 25例；妊娠并發(fā)癥13例；肝素治療10例

2.3 最終NIPT失敗的33例樣本的臨床資料144例重新取樣的樣本中，最終有33例未獲得有效的結(jié)果，包括cffDNA濃度低所致24例、Z值處于“灰區(qū)”8例及MCA 1例。在24例cffDNA濃度低的樣本中，雙胎妊娠3例，BMI＞25的11例，有妊娠期并發(fā)癥的3例，檢測前有肝素治療的1例。在8例Z值處于“灰區(qū)”的樣本中，雙胎妊娠1例，BMI＞25的3例，有妊娠期并發(fā)癥的3例，檢測前有肝素治療的1例（表2）。

表2 NIPT失敗的33例樣本的臨床資料Tab.2 Clinical data of 33 cases of NIPT failure ±s

表2 NIPT失敗的33例樣本的臨床資料Tab.2 Clinical data of 33 cases of NIPT failure ±s

原因分布cffDNA濃度低Z值處于“灰區(qū)”Z13“灰區(qū)”Z18“灰區(qū)”Z21“灰區(qū)”Z13.21“灰區(qū)”質(zhì)控因素總計(jì)例數(shù)24孕周數(shù)（周）17.60±1.32 BMI（kg/m2）25.20±3.22備注雙胎妊娠3例；BMI＞25 11例；妊娠并發(fā)癥3例；肝素治療1例8 1 2 5 0 1 3 3占比（%）72.73 24.24 3.03 6.06 15.15 0 3.03 100 17.31±1.5624.81±2.89雙胎妊娠1例；BMI＞25 3例；妊娠并發(fā)癥3例；肝素治療1例///17.42±1.6425.17±3.14雙胎妊娠4例；BMI＞25 14例；妊娠并發(fā)癥6例；肝素治療2例

2.4 重新取樣并獲得有效NIPT結(jié)果的111例樣本兩次臨床資料的比較二次取樣有111例樣本最終獲得有效的NIPT結(jié)果，包括原cffDNA低的58例、原Z值處于“灰區(qū)”的49例及原質(zhì)控因素的4例。比較這111例樣本檢測成功前后的臨床資料后發(fā)現(xiàn)，平均孕周數(shù)由（17.21±1.54）變?yōu)椋?9.65±1.21）周，平均體質(zhì)量指數(shù)由（23.26±3.15）kg/m2變?yōu)椋?3.92 ± 3.70）kg/m2，肝素治療者由4例變?yōu)?例，雙胎妊娠及妊娠并發(fā)癥例數(shù)前后沒有變化（表3）。

2.5 NIPT檢測失敗的隨訪結(jié)果24例胎兒濃度低檢測失敗的孕婦中2例失訪，1例因孕期并發(fā)癥放棄生產(chǎn)，1例因胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常引產(chǎn)，5例補(bǔ)做血清學(xué)篩查/NIPT，10例行羊膜腔穿刺術(shù)，未做任何處理者5例。10例羊膜腔穿刺術(shù)中檢出1例 47，XN，+21和 1例 46，XN，t（1；16）（p32；q12），其余8例均未見異常（表4）。8例處于“灰區(qū)”的孕婦除1例雙胎因擔(dān)心手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)拒絕手術(shù)，其余均進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)，檢出1例47，XN，+21（表5）。

表3 重新取樣后NIPT檢測成功的111例樣本臨床資料變化表Tab.3 Changes of clinical data of 111 cases with successful NIPT detection after resampling ±s

表3 重新取樣后NIPT檢測成功的111例樣本臨床資料變化表Tab.3 Changes of clinical data of 111 cases with successful NIPT detection after resampling ±s

注：與首次取樣相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P＜0.05

臨床資料首次取樣重新取樣孕周數(shù)（周）17.21±1.54 19.65±1.21*BMI（kg/m2）23.26±3.15 23.92±3.70肝素治療（例） 妊娠并發(fā)癥（例）4 1雙胎妊娠（例）13 13 6 6

表4 24例因兩次胎兒濃度低檢測失敗的隨訪結(jié)果Tab.4 Follow-up results of 24 failures due to low fetal concentration

3 討論

世界衛(wèi)生組織2011年指出，全球每年約有790萬嬰兒發(fā)生嚴(yán)重的出生缺陷疾病。近年來，我國隨著“二孩政策”的開放，高齡孕產(chǎn)婦比例增加，隨之伴隨的出生缺陷總量增加，約為出生總?cè)丝诘?.6%，出生缺陷也成為我國嬰兒死亡的主要原因之一［10］。染色體非整倍體異常是常見的出生缺陷，目前尚無有效的治療方法，因此對孕婦進(jìn)行產(chǎn)前篩查，對高危胎兒進(jìn)一步的產(chǎn)前診斷、及時采取處理措施是降低此類出生缺陷的唯一策略。

表5 8例“灰區(qū)”隨訪結(jié)果Tab.5 Follow-up results of 8 cases of borderline z-score

NIPT作為臨床產(chǎn)前篩查的重要補(bǔ)充，對孕婦外周中游離DNA片段（包括cffDNA）進(jìn)行測序，通過比對參考序列而獲得每條染色體序列位置信息，可同時檢測21-三體、18-三體、13-三體以及部分性染色體非整倍體異常。據(jù)統(tǒng)計(jì)，NIPT對于21、18、13-三體的總體檢出率為99.02%，特異性為99.86%，陽性預(yù)測值為85.27%［11］。然而，在實(shí)際工作中NIPT仍存在待解決的問題。胎兒游離DNA是來源于凋亡的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞，經(jīng)胎盤屏障時受母體免疫細(xì)胞攻擊，從胎盤的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中進(jìn)入母血自然降解的DNA片段［12］，因此NIPT檢測的母體外周血中胎兒游離DNA要受胎兒和母體兩方面的影響。孕婦的年齡、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、妊娠期并發(fā)癥、取樣時的孕周均會影響cffDNA的濃度。CffDNA的濃度與采血孕周呈正相關(guān)性，隨著孕周的增加，凋亡的胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞增多，釋放入血的DNA片段隨之增加［3］。孕期的體質(zhì)量增加，血容量增加會導(dǎo)致外周血中總體DNA含量升高，相對cffDNA濃度降低［6-7］。對于BMI＞40 kg/m2的孕婦，不建議NIPT檢測。母體中的胎兒游離DNA濃度過低，異常的胎兒DNA可能受母體正常的DNA影響而無法檢出，因此要求孕婦重取樣檢測。HUDEVOVA等［13］曾在2014年報(bào)道，cffDNA越低，異常染色體越不容易檢出，因cffDNA濃度低造成NIPT失敗的人群胎兒非整倍體的風(fēng)險(xiǎn)更高。SUZUMORI等［14］也曾指出三體的胎兒也會影響胎兒游離DNA的濃度，從而影響NIPT的檢測。此外，由于肝素中的部分物質(zhì)有可能會抑制NIPT檢測過程中Taq DNA聚合酶的活性，影響GC含量，因此肝素的使用也是造成NIPT失敗的因素之一［15］。

本研究統(tǒng)計(jì)了兩年來的23 704例NIPT結(jié)果，發(fā)現(xiàn)NIPT最終失敗率為0.14%，低于文獻(xiàn)報(bào)道［16］。在154例首次需要重新取樣的病例中，胎兒濃度低及Z值處于“灰區(qū)”是兩個主要的原因，占比分別是 57.14%（88/154）和 39.61%（61/154），另外還有5例是質(zhì)控因素所致。這些樣本中包括雙胎妊娠18例，BMI＞25的25例，有妊娠期并發(fā)癥的13例，檢測前有肝素治療的10例。而在最終失敗的33例樣本中，胎兒濃度低及Z值處于“灰區(qū)”仍是主要原因，并且雙胎妊娠、BMI值、妊娠并發(fā)癥及肝素治療樣本仍然占據(jù)一定比例。通過再次取樣，在154例樣本中有111例獲得了有效的結(jié)果，這期間孕周數(shù)由（17.21±1.54）周增加為（19.65±1.21）周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BMI值無明顯變化，并且有4例患者檢測前停止了肝素治療，這些因素都提高了NIPT檢測成功的可能性。

通過隨訪追蹤發(fā)現(xiàn)，24例因胎兒濃度低導(dǎo)致的NIPT失敗，10例后經(jīng)羊水穿刺后檢出1例21-三體綜合征及1例平衡易位，異常染色體達(dá)8.33%。NIPT對于Z值第一次建庫在“灰區(qū)”的樣本按規(guī)范重新建庫，第二次仍處于灰區(qū)的樣本要求重取樣檢測。Z值是測序數(shù)據(jù)經(jīng)過處理、GC校正后得到的風(fēng)險(xiǎn)判斷值［17］，Z值大于提示高風(fēng)險(xiǎn)，小于-3表示染色體檢測值偏低，整體染色體偏少。在隨訪中筆者發(fā)現(xiàn)1例21-三體引產(chǎn)，其余新生兒正常，異常比例為12.50%。此外，實(shí)驗(yàn)操作過程中導(dǎo)致的總DNA量低、DNA建庫濃度低、測序數(shù)據(jù)量不足、低胎兒濃度、實(shí)驗(yàn)檢測流程及其他質(zhì)控步驟等方面均可導(dǎo)致NIPT檢測失敗［18］。在本研究中，初次取樣發(fā)現(xiàn)4例GC孤立和1例多條染色體離群（MCA）兩次建庫均未通過質(zhì)控，再次取樣后仍有一例提示多條染色體離群。

值得注意的是，隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，雙胎及多胎的比例逐漸增加?！对袐D外周血游離胎兒DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》建議雙胎人群慎用NIPT檢測。兩項(xiàng)關(guān)于雙胎的數(shù)據(jù)也表明［19-21］，NIPT對21-三體和18-三體的陽性預(yù)測值明顯低于單胎。然而“試管嬰兒”來之不易，雙胎妊娠進(jìn)行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷時更容易導(dǎo)致流產(chǎn)早產(chǎn)，需要承擔(dān)更大的風(fēng)險(xiǎn)。對于血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)或者高齡的孕婦，NIPT失敗后擔(dān)心手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)拒絕羊膜腔穿刺。對此，國內(nèi)外學(xué)者通過瓊脂糖凝膠電泳富集胎兒片段DNA提高濃度的方法進(jìn)行NIPT取得了較好的效果［22-23］。

綜上所述，NIPT的影響因素眾多，孕婦的年齡、體質(zhì)量指數(shù)、妊娠期并發(fā)癥、取樣時間、母源性染色體核型異常均會導(dǎo)致NIPT結(jié)果不一致［24-25］。實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)范操作，臨床醫(yī)生需要為孕婦提供準(zhǔn)備的詳細(xì)咨詢，對于不符合NIPT收樣的人群應(yīng)根據(jù)個人情況建議行產(chǎn)前診斷。