代乳粉添加女貞子對羔羊生長性能、免疫和抗氧化功能的影響

喬國華 ，索朗達，吳玉江，德 吉，巴 貴，次仁德吉，解鐵民，肖志剛，陳興月

（1.沈陽師范大學糧食學院，遼寧沈陽 110034；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院畜牧研究所，西藏拉薩 850000）

湖羊是中國代表性綿羊品種，產(chǎn)羔率在200%以上，一胎多羔。母乳通?？梢晕桂B(yǎng)1～2 羔，其他1～2 羔將死于饑餓[1]，因此實際生產(chǎn)中多采用人工飼喂以免于羔羊死亡。人工飼喂羔羊常用牛乳或重新調(diào)配的代乳粉，但由于其乳糖含量較高（35%～39%），羔羊死于真胃臌氣的比例超過5%[2]。研究證明，羊乳與牛乳的成分差別很大，羊乳粉的乳糖含量（一般為25%）比牛乳低，乳脂肪比牛乳高（32% vs 28%），乳蛋白比牛乳高（30%vs 26%）[3-6]。初生羔羊非常容易受到很多環(huán)境因素影響，如低溫和病原微生物。為抵抗這些病原微生物，土霉素等抗生素被廣泛用做飼料藥物添加劑，但使用抗生素產(chǎn)生耐藥菌株等問題引發(fā)關注，無抗飼養(yǎng)成為大勢所趨。中草藥作為綠色飼料添加劑，在牛、羊、豬、雞的養(yǎng)殖上得到廣泛應用。早期研究證明，女貞子有改善育成期奶牛免疫狀態(tài)的作用，可提高血漿中免疫球蛋白G和免疫球蛋白E[7]。添加女貞子也能夠提高綿羊血液抗氧化功能[8]。本試驗旨在研究羔羊奶粉添加女貞子對羔羊生長性能、免疫和抗氧化功能的影響，為女貞子在將來無抗飼養(yǎng)提供基礎研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 女貞子粉制取 女貞子果實購于沈陽同仁堂藥店，用微膠囊技術(shù)進行處理以增加其懸浮性。女貞子果實在65℃烘箱中烘干48 h。冷卻到室溫時，用藥物專用粉碎機粉碎（HK1100B，哈爾濱制藥六廠），過100目篩。流體床（Type TL-GHX-IIα，江蘇）對女貞子粉末制粒。具體參數(shù)：床扇速度1 150 r/min，泵速7 min-1，霧化壓力0.16 MPa，物料溫度40～45 ℃，制粒時間45 min。5.0% 麥芽糊精（w/v）和0.15% 黃原膠（w/v）用作粘合劑。制粒后取樣，用高效液相色譜測定熊果酸（OA）和齊墩果酸（UA）含量（Waters Technologies Inc.，USA）。0.5 g 粉末溶解于25 μL 甲醇。超聲波提取30 min 并且用0.4 μm 濾膜過濾。取1μm 進樣。色譜柱子為 ACE EXCEL 3 μm Super C18，50 mm×2.1 mm柱子，條件：40℃，流速0.42 mL/min，檢測波長214 nm，流動相為乙腈-甲醇-水，含有0.1%磷酸（52:33:15，三乙胺調(diào)整pH 到6.5）；雄果酸和齊墩果酸的出峰時間分別為11.51 min 和12.31 min。女貞子粉顆粒13.263 mg/gOA和2.771 mg/gUA。土霉素購自于Bayer-Sino 公司（德國）。

1.2 代乳粉試驗 在山東省莘縣天牧母羊飼養(yǎng)場進行。母羊飼喂全混合日糧（TMR），精粗比為65:35（干物質(zhì)基礎），自由采食。粗飼料為羊草和黃貯，各占50%。精飼料含有粗蛋白質(zhì)217 g/kg，總可消化養(yǎng)分為736 g/kg，由北京三元禾豐牧業(yè)有限公司提供。選擇泌乳日齡為5～55 d 的第2 胎母羊60 只分析其乳成分（NIR，Milko-Scan 133B；Foss Electric，DK-3400 Hiller?d，Denmark）。水分和灰分采用AOAC（1997）的方法。每只母羊乳取5 mL，混合60 只母羊乳，凍干，原子吸收法分析常量元素Ca、Mg、Na、K 含量和微量元素Zn、Mn、Co、Fe、Cu、Se 含量（AAS-3000，DAFURY，北京）。湖羊母羊乳蛋白、乳脂肪和乳糖含量分別為4.45%、5.58%和4.58%。代乳粉配方及營養(yǎng)成分見表1。

1.3 試驗設計 試驗采用完全隨機試驗設計。選擇3 日齡羔羊90 只（從母羊分離），隨機分成3 組，每組5個重復，每個重復6 只羔羊，公、母各半。對照組為代乳粉組，女貞子粉組飼喂為代乳粉+30 g/kg 女貞子粉），土霉素組為代乳粉+1 g/kg 土霉素。每個重復羔羊單欄人工飼養(yǎng)。試驗期為2017 年5 月10 日—2017 年6 月26 日，期間平均環(huán)境溫度為14.9～19.8℃。

1.4 飼喂管理 選定的羔羊打耳標并精確稱重。每周用ClO2對所有圍欄消毒1 次。代乳粉在36℃蒸餾水條件下按照16.7%（w/v）比例進行混合。采用自制喂奶器進行飼喂。每個喂奶器上安裝有6 個人工乳頭。初生1～3 d 采食初乳（免疫球蛋白濃度在5 000～8 000 mg/100mL）；第4～10 天每天飼喂4 次，每次25 g 代乳粉；第11～18 天每天飼喂3 次，每次38 g 代乳粉；第19～46 天每天飼喂2 次，每次50 g 代乳粉；第46 天斷奶；自由飲水，第4 天開始自由采食紫花苜蓿和精飼料（北京三元禾豐牧業(yè)有限公司）。精補料（不添加藥物）為顆粒飼料：55%粉碎玉米，14%粉碎燕麥，25%粉碎大麥，5%甜菜糖蜜和1%預混料。每千克精補料含有代謝能12.17 MJ，蛋白質(zhì)105 g，鈣1.5 g，維生素A 6 500 IU，維生素D31 000 IU，維生素E 75 mg 和硒0.3 mg。記錄每天紫花苜蓿和顆粒飼料的采食量。每天觀察羔羊的健康、腹瀉和真胃臌氣情況。羔羊尾根處有明顯糞污視為腹瀉，腹瀉率=組內(nèi)腹瀉羔羊數(shù)/ 組中羔羊數(shù)×100%。羔羊腹部有明顯充氣（鼓肚子）視為真胃臌氣。

表1 代乳粉配方組成及營養(yǎng)成分（濕基）

1.5 測定指標及方法

1.5.1 血樣及血液指標 分別在10、17、24、31 日齡晨飼前對每個重復3 只羔羊頸靜脈采血。血液樣品在37℃水域斜面條件下靜置1.5 h。取上清液儲存于-20℃冰箱中待測。血清IgA 和IgG 和IgM 用ELISA 試劑盒進行測定（Montgomery，TX，USA）。前列腺素（PGE2）和可的松采用試劑盒進行測定（上海酶聯(lián)科技有限公司）。血清IL-1β、IL-6 和IL-8 采用ELISA 試劑盒進行 測 定（Groundwork Biotechnology Diagnosticate，San Diego，CA，USA）。血清谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）采用試劑盒進行測定（北京索萊寶科技有限公司）。

1.5.2 體尺及體重 根據(jù)Adebayo[9]的方法在46 日齡測定體重和體尺，體尺指標包括肩胛高度、尻高度、體長和胸圍。

1.6 統(tǒng)計分析 采用SAS 9.1 軟件中One-Way ANOVA過程進行統(tǒng)計分析。羔羊腹瀉率和腹瀉天數(shù)采用卡平方χ2檢驗。顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 添加女貞子對羔羊腹瀉和真胃臌氣的影響 從表2可以看出，試驗期內(nèi)所有羔羊無死亡現(xiàn)象。對照組羔羊的腹瀉率和腹瀉天數(shù)分別70% 和46 d，高于女貞子組和土霉素組（P＜0.05）。女貞子組和土霉素組羔羊沒有真胃臌氣發(fā)生。

表2 添加女貞子對羔羊腹瀉率，死亡和真胃臌氣的影響

2.2 添加女貞子對羔羊飼料采食量、體重和體尺指標的影響 從表3 可以看出，女貞子組和土霉素組羔羊的精飼料采食量都高于對照組（P＜0.05）。女貞子組羔羊的紫花苜蓿采食量高于其他2 組（P＜0.05）。女貞子組和土霉素組羔羊的末重和平均日增重均高于對照組（P＜0.05）。女貞子組和土霉素組羔羊的肩胛高度、尻高度、體長和胸圍均高于對照組（P＜0.05）。

2.3 添加女貞子對羔羊血液免疫球蛋白和白細胞介素的影響 如表4 所示，土霉素組和女貞子組羔羊17、24 日齡血液IgG 濃度高于對照組（P＜0.05），女貞子組和土霉素組羔羊的IgG 濃度無顯著差異。代乳粉中加入女貞子或土霉素在整個試驗期并未改變羔羊的血液IgE 和IgA 濃度（P＞0.05）。女貞子組和土霉素組羔羊17、24、31 日齡血液IL-1β、IL-6 和IL-8 濃度均較對照組低（P＜0.05）。

表3 添加女貞子對羔羊采食量、體重和體尺指標的影響

表4 女貞子對人工飼喂羔羊免疫的影響

2.4 添加女貞子或者土霉素對羔羊應激激素的影響 從表5 可以看出，女貞子組和土霉素組羔羊24、31 日齡血液可的松、PGE2濃度均低于對照組（P＜0.05）。女貞子組和土霉素組羔羊的可的松濃度和PGE2濃度無顯著差異。

表5 女貞子對人工飼喂羔羊應激激素的影響

2.5 添加女貞子對羔羊血液抗氧化功能的影響 如表6所示，女貞子組和土霉素組羔羊24、31 日齡血液SOD濃度均高于對照組（P＜0.05）。女貞子組和土霉素組羔羊17、31 日齡血液MDA 濃度低于對照組（P＜0.05）。

表6 女貞子對人工飼喂羔羊抗氧化功能的影響

3 討 論

3.1 代乳粉對真胃臌氣率和腹瀉率的影響 關于代乳粉對山羊羔羊的生長、消化和代謝的影響已有較多研究報道。鮮有針對于綿羊羔羊進行的試驗研究。Anderson 等[3]報道，綿羊乳成分與山羊乳成分有很大區(qū)別。綿羊乳的乳蛋白和乳脂肪高于山羊，而乳糖低于山羊[4-6]。Pulina等[10]報道，Sarda 母羊（意大利綿羊）乳中脂肪和蛋白質(zhì)分別達6.5%和5.8%。本試驗所測得的湖羊乳蛋白、乳脂肪和乳糖含量分別為4.45%、5.58%和4.58%。這些結(jié)果說明羊乳的成分構(gòu)成存在種屬特異性，山羊與綿羊乳成分有差異，而且不同品種綿羊的乳成分上也有差異。Edward 等[2]報道，臌氣是由似肉瘤細菌（Sarcina-like bacteria）引起，這種菌棲居在幼齡反芻動物胃腸道中，對乳糖發(fā)酵速度較快，產(chǎn)生較多的氣體，引起臌氣。本試驗制備的代乳粉中含25% 乳糖。而牛乳中的乳糖含量較高，一般為35%～39%。本試驗使用的代乳粉營養(yǎng)組分與母乳相近，可較好預防真胃臌氣的發(fā)生，這說明羔羊真胃臌氣很有可能與代乳粉中乳糖比例有關。對照組羔羊較高的腹瀉率和較長的腹瀉天數(shù)說明代乳粉中添加女貞子粉或土霉素可較好預防羔羊腹瀉。

3.2 添加女貞子粉對羔羊采食量和生長性能的影響 初生幼畜會受到一些環(huán)境致病菌（如大腸桿菌和真菌等）侵染。這個時期的家畜很容易處于應激狀態(tài)，采食量降低，生產(chǎn)性能也隨之降低。本研究結(jié)果表明，對照組羔羊精飼料采食量和生產(chǎn)性能均有所下降，體尺指標下降；而添加女貞子的代乳粉提高了羔羊紫花苜蓿的采食量，且體重和體尺指標均較對照組有顯著提高。Qiao 等[7]試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加女貞子（100 g/d）提高了荷斯坦后備牛對纖維的采食量和消化率。這可能是由于女貞子粉提高了瘤胃內(nèi)纖維降解菌活性，從而提高了纖維的消化率。但需要進一步用體內(nèi)試驗證實這一論斷。

3.3 添加女貞子粉對羔羊免疫功能的影響 中草藥可以加強肉仔雞[11]、蛋雞[12]、仔豬[13-14]、綿羊[8]、后備牛[7]和奶牛[15]等動物的免疫功能、提高血漿IgG 和IgA 濃度。本試驗結(jié)果表明，3 個處理組羔羊24 日齡血漿IgG 濃度下降趨勢一致，31 日齡開始提高。這與Lindsey 等[16]在犢牛上的研究結(jié)果一致。這一現(xiàn)象表明羔羊24 日齡內(nèi)的免疫功能主要來源于母乳中的IgG，屬于被動免疫。而在31 日齡以后羔羊需要動員機體功能來建立自身的主動免疫，合成自身的抗體。本試驗中女貞子組和土霉素組的羔羊24 日齡前血漿IgG 的下降趨勢明顯低于對照組，表明添加女貞子粉或土霉素的代乳粉可以起到抵抗病原微生物和減少對母乳中IgG 消耗的作用。

熊果酸、齊墩果酸、二氫熊果酸和優(yōu)帕托林是女貞子的主要有效成分，尤其是熊果酸和齊墩果酸（均屬于五環(huán)三萜類羧酸）有抵抗病原菌、抗炎癥和降低IL-1β、IL-6 和TNF-α的作用[17-19]。本試驗使用的女貞子果實中含有齊墩果酸和熊果酸的含量分別為2.77、13.26 mg/g。細胞因子（如IL-1β、IL-6 和IL-8）可反映機體免疫狀態(tài)，其中IL-1β是必需促炎癥因子，起到調(diào)控腫瘤細胞的作用，IL-6 是腫瘤細胞分泌的細胞因子，而IL-8 是介導急性炎癥反應的主要細胞因子[20]。Alejandra 等[17]報道，0.5 mg/kg 體重的熊果酸降低了炎癥因子IL-6 水平，提高了大鼠的免疫狀態(tài)。Seungye 等[18]報道，熊果酸顯著降低了炎癥反應，伴隨著抑制促炎癥因細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-21 和IL-17 的表達，同時降低了氧化應激標記物——硝基酪氨酸和誘導性一氧化氮合酶（iNOS）的表達，結(jié)果NO合成量降低。Feng 等[19]進一步在脂多糖誘導NO 炎癥大鼠的研究證實，齊墩果酸和熊果酸表現(xiàn)出了較高的抑制NO 合成的作用，其機理是抑制NO 合成，從而發(fā)揮抗擊炎癥的作用。從整個試驗來看，對照組羔羊的IL-1β、IL-6 和IL-8 水平有所提高，而女貞子組和土霉素組羔羊17～31 日齡IL-1β、IL-6 和IL-8 水平顯著降低。這說明對照組羔羊處于相對較差的免疫狀態(tài)，同時說明女貞子是通過抑制炎癥因子IL-1β、IL-6 和IL-8 來提高羔羊的免疫狀態(tài)。女貞子是否可以抑制NO 合成，需要進行體內(nèi)試驗證實。

3.4 添加女貞子對羔羊應激激素的影響 在豬[21]、山羊[22]、母豬[23]上的研究發(fā)現(xiàn)，從母畜隔離的初生家畜會受到很多環(huán)境因素影響，其中包括病原微生物、低溫環(huán)境和代乳粉。這些應激因素刺激來源于下丘腦-腎上腺軸的可的松和PEG2分泌，進而降低精飼料采食量和生長性能，并且使初生家畜的健康狀態(tài)和免疫狀態(tài)惡化。本試驗中，對照組羔羊血清可的松和PGE2水平高于其他2個組，表明對照組羔羊處于較大程度上的應激狀態(tài)。羔羊較低的采食量和較低生長性能可能與應激激素水平提高有關。

3.5 添加女貞子對羔羊抗氧化狀態(tài)的影響 相關研究指出，當動物處于較差的抗氧化狀態(tài)時，總是伴隨著低濃度的血液SOD 和/或GSH，和較高濃度的MDA，同時生產(chǎn)性能明顯降低[7,12]，血液SOD 和/或GSH、MDA（細胞膜脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物）分別與動物的抗氧化狀態(tài)呈正相關、負相關。由于細胞膜不飽和脂肪酸的氧化使細胞膜的正常結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，造成生產(chǎn)性能降低[24]。熊果酸和齊墩果酸是女貞子的主要活性成分，有提高抗氧化和保護肝臟的作用[12]。Chen 等[25]報道，齊墩果酸和熊果酸都有穩(wěn)定脂質(zhì)體膜的作用，同時證明女貞子水提物有改善氧化還原穩(wěn)態(tài)的作用，機理是通過增加血清總抗氧化能力來降低MDA 和8-羥基脫氧鳥苷。本試驗中，添加女貞子改善了血液抗氧化功能，提高了SOD 水平，降低了MDA 水平，表明添加女貞子可提高羔羊抗氧化性能。

4 結(jié) 論

試驗用代乳粉的營養(yǎng)成分與母羊的自然乳基本一致，可以有效降低羔羊真胃臌氣的發(fā)病率；添加女貞子粉的代乳粉可以降低腹瀉的發(fā)生率，還可以降低促炎癥因子IL-1β、IL-6 和IL-8，通過提高IgG 水平改善羔羊主動免疫功能，并且可以通過降低可的松和PGE2水平來緩解應激；同時通過提高SOD 和降低MDA 的方式來改善抗氧化狀態(tài)。