苯基丙氨酸修飾石墨烯平面電極對(duì)西酞普蘭的靈敏檢測(cè)

崔一鳴， 路麗琴， 羅紅霞*

(中國(guó)人民大學(xué)化學(xué)系，北京 100872)

西酞普蘭(CIT)是一種選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)，為外消旋體。CIT可以選擇性地抑制5-羥色胺(5-HT)轉(zhuǎn)運(yùn)體[1]，阻斷突觸前膜對(duì)5-HT的再攝取，延長(zhǎng)和增加5-HT的作用[2]，從而產(chǎn)生抗抑郁作用[3]，該藥已被廣泛應(yīng)用于抑郁癥的治療中。近年來(lái)，關(guān)于CIT以及其他類抗抑郁藥物的研究，尤其是在關(guān)于患者血清[4]乃至母乳內(nèi)的藥物含量測(cè)定[5]引起了廣泛的關(guān)注。因此對(duì)CIT進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法的需求也日益增加。目前已有多種關(guān)于CIT的檢測(cè)方法，其中包括比色法[6]、質(zhì)譜法[7]、電泳法[8]以及電化學(xué)方法等。其中，電化學(xué)方法簡(jiǎn)便、快捷、靈敏、成本低，倍受研究者們的關(guān)注[9]。

苯基丙氨酸(PHE)是人體必需的氨基酸之一，它有著特殊的生物活性，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品以及營(yíng)養(yǎng)品工業(yè)中[10]。在分析檢測(cè)中，PHE以及聚PHE分子由于其與生物分子特有的作用效果、催化性質(zhì)以及π-π共軛的作用，常被用于電極的改良，并取得了顯著效果[11 - 12]。石墨烯是一種二維碳納米材料，它由sp2雜化的C原子組成。因其比表面積大，導(dǎo)電導(dǎo)熱性好，電化學(xué)穩(wěn)定，機(jī)械強(qiáng)度高，石墨烯幾乎可以被應(yīng)用于材料研究的所有領(lǐng)域[13 - 14]。在眾多制備石墨烯的方法中，由化學(xué)氣相沉積法(CVD)制備而得的石墨烯具有可以大面積制備、層數(shù)可控、電化學(xué)性能好等優(yōu)勢(shì)[15 - 16]。因此CVD法制得的石墨烯可以不經(jīng)處理直接被應(yīng)用于制作電極并應(yīng)用于電化學(xué)測(cè)定[17]，而且該石墨烯的邊緣和面都具有較好的電化學(xué)性能[18]。我們研究小組曾將CVD法石墨烯的邊緣制備成納米線電極，應(yīng)用于一些生物分子的高靈敏檢測(cè)[19 - 20]。我們還將CVD法石墨烯面轉(zhuǎn)移到聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)表面，制成石墨烯平面電極(GPE)，并通過(guò)電化學(xué)方法再對(duì)GPE表面進(jìn)行修飾，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種生物分子的選擇性或同時(shí)檢測(cè)[21 - 22]。本研究在上述工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)電化學(xué)方法在GPE上沉積PHE，并將得到的PHE/GPE用于CIT的檢測(cè)。該體系結(jié)合了GPE優(yōu)越的電化學(xué)性質(zhì)以及PHE的獨(dú)特生物活性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CIT靈敏快捷地測(cè)定。這種檢測(cè)方法檢出限低、穩(wěn)定性好、簡(jiǎn)單方便，有望應(yīng)用于生命、醫(yī)學(xué)的研究領(lǐng)域。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

CHI660D型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，采用三電極系統(tǒng)：工作電極為GPE或PHE/GPE，參比電極為Ag/AgCl電極，對(duì)電極為鉑絲電極。Sartorius PB-10 pH計(jì)(德國(guó)，Sartorius)；掃描電子顯微鏡和能譜儀(日本，JEOL 7401F)、拉曼光譜儀(日本，Lab Ram HR Evolution)。

銅基底少層CVD法石墨烯(深圳六碳科技有限公司)；聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)(Aladdin)；L-纈氨酸(Aladdin)；PET(厚度為250 mm，深圳市極致薄膜科技有限公司)；葡萄糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；苯基丙氨酸、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、尿酸(BIO BASIC INC)；多巴胺(Acros-Organics)；西酞普蘭(Adamas-Beta)；支持電解質(zhì)為0.1 mol/L的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(PBS)。所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q(美國(guó)Millipore公司)去離子水。

草酸艾司西酞普蘭片(山東京衛(wèi)制藥有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石墨烯電極的制備如圖1所示，采用高分子支撐法，將銅基底上的大面積少層石墨烯(GR)轉(zhuǎn)移到柔性透明的PET基底上。具體步驟如下：在銅基底的石墨烯上均勻涂抹1%(w/w)的PMMA苯甲醚溶液，自然晾干，以作為石墨烯薄膜的支撐，避免在轉(zhuǎn)移過(guò)程中造成破損；在恒溫箱中于120 ℃干燥5 min，自然冷卻。然后將PMMA/GR/Cu浸泡在1 mol/L FeCl3和0.1 mol/L HCl混合溶液中刻蝕掉Cu；用去離子水清洗PMMA/GR，并轉(zhuǎn)移到PET基底上，室溫干燥。將PMMA/GR/PET在丙酮中浸泡24 h，以去除支撐石墨烯的PMMA。取出晾干，用絕緣膠帶將GR/PET纏成0.3×0.3 cm的薄片，石墨烯和電極引線之間通過(guò)銅膠帶連接，即可得到GPE[15 - 16]。

2.2.2 PHE/GPE的制備以GPE為工作電極，在含2 mmol/L PHE和0.1 mol/L PBS(pH=6.0)中，在-0.4～1.6 V范圍內(nèi)連續(xù)掃描40圈，將苯基丙氨酸修飾到GPE上，得到PHE/GPE(圖1)。

圖1 石墨烯平面電極(GPE)和苯基丙氨酸修飾石墨烯平面電極(PHE/GPE)的制備過(guò)程示意圖Fig.1 The schematic illustration of the construction of the graphene platform electrode(GPE)and the PHE modified GPE(PHE/GPE)

2 結(jié)果與討論

2.1 PHE/GPE的表征

從石墨烯在銅基底(圖2A)以及PET基底(圖2B)上的掃描電鏡(SEM)圖可以看出，石墨烯在轉(zhuǎn)移到PET上后延續(xù)了其在銅基底上完整和平滑的性質(zhì)。而在PHE/GPE的掃描電鏡圖(圖2C,2D)中可以看出，經(jīng)過(guò)電化學(xué)沉積后PHE已經(jīng)成功修飾在了GPE表面，并呈現(xiàn)棒狀聚集的形態(tài)，每個(gè)粒子的大小在2 μm左右。在PHE/GPE的能譜(EDS)圖中，N元素具有較高的峰，而PET基底和石墨烯中都沒(méi)有N元素的存在，這也說(shuō)明含氮的PHE成功地修飾在了GPE上(圖2E)。同時(shí)修飾后的電極O、C比變大，說(shuō)明在修飾過(guò)程中石墨烯發(fā)生了活化。在活化的過(guò)程中，石墨烯的結(jié)構(gòu)上形成了諸多含氧基團(tuán)，從而提高了GPE的電極活性[23]。

電化學(xué)阻抗圖譜能夠展現(xiàn)出電子在電極上的傳輸情況，由圖3A可以看出，PHE/GPE與GPE相比，圖譜在高頻區(qū)的半徑變小，說(shuō)明修飾過(guò)程使電子在電極表面?zhèn)鬟f的電阻Ret變小[24]；而用于K3[Fe(CN)6]的循環(huán)伏安測(cè)定時(shí)(圖3B)，PHE/GPE上峰電流要小于GPE上的峰電流，這可能是苯基丙氨酸在溶液中呈現(xiàn)負(fù)電，與[Fe(CN)6]3-相斥所造成的[25]。

圖2 (A)銅片上石墨烯的掃描電鏡(SEM)圖；(B)GPE的SEM圖；(C、D)PHE/GPE的SEM圖；(E)GPE的能譜(EDS)圖；(F)PHE/GPE的EDS圖Fig.2 (A)The SEM image of graphene on Cu；(B)The SEM image of GPE；(C and D)The SEM image of PHE/GPE；(E)The EDS of GPE；(F)The EDS of PHE/GPE

通過(guò)拉曼光譜圖(圖3C)可以看出，石墨烯在1 327 cm-1、1 563 cm-1和2 676 cm-1處有三個(gè)特征峰，其中峰G和峰2D的大小接近，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所用的石墨烯為少層石墨烯，而通過(guò)峰D和峰G的大小之比的變化，說(shuō)明缺陷程度增大，證明了在轉(zhuǎn)移過(guò)程中石墨烯發(fā)生了活化[26]。

2.2 CIT在PHE/GPE上的電化學(xué)響應(yīng)

圖3D為CIT在PHE/GPE以及GPE上的循環(huán)伏安圖。從圖中可以看出，PHE/GPE以及GPE都可以對(duì)CIT產(chǎn)生特定的電化學(xué)響應(yīng)并產(chǎn)生一個(gè)氧化峰，而CIT在PHE/GPE上產(chǎn)生的峰電流要明顯高于在GPE上產(chǎn)生的峰電流。這說(shuō)明PHE對(duì)石墨烯電極測(cè)定CIT具有促進(jìn)作用。PHE修飾在GPE上后，電極的比表面積明顯增大，同時(shí)由于PHE特有的生物活性以及氧化還原性質(zhì)[27]，對(duì)CIT在電極上的氧化起到了明顯的催化作用。

圖3 (A)GPE和PHE/GPE在含有1 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3-和0.1 mol/L KCl溶液中的阻抗譜圖(頻率從0.01 Hz到100 Hz)；(B)GPE和PHE/GPE在[Fe(CN)6]3-溶液中的循環(huán)伏安(CV)圖；(C)轉(zhuǎn)移在PET基底上的石墨烯(a)和銅基底上石墨烯(b)的拉曼光譜圖；(D)GPE(a、c)和PHE/GPE(b、d)在不含CIT(a、b)和含有20 μmol/L CIT(c、d)的0.1 mol/L PBS(pH=9.0)中的CV圖(掃速：0.025 V/s)Fig.3 (A) Nyquist plot of pristine GPE and PHE/GPE in 0.1 mol/L KCl containing 1 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3-(between 0.01 Hz and 100 Hz)；(B)CVs obtained at GPE(a and c) and PHE/GPE(b and d) in 0.1 mol/L KCl containing 1 mmol/L [Fe(CN)]3-)；(C) The Raman spectra of graphene on silicon wafer(a) and copper sheet(b)；(D) CVs obtained at GPE(a and c) and PHE/GPE(b and d) in 0.1 mol/L PBS(pH=9.0) in the absence(a and b) and presence(c and d) of 20 μmol/L CIT(Scan rate:0.025 V/s)

2.3 PHE在GPE上修飾條件以及CIT檢測(cè)條件的優(yōu)化

從圖4A可以看出，增加沉積圈數(shù)可以使相應(yīng)的CIT響應(yīng)峰電流增大，且當(dāng)沉積圈數(shù)達(dá)到40圈時(shí)峰電流達(dá)到最大，當(dāng)沉積圈數(shù)超過(guò)40圈時(shí)，峰電流減小。這是因?yàn)樵诔练e圈數(shù)增大時(shí)，沉積在GPE上的PHE顆粒增多，使電極的表面積以及活性都能增大，但是當(dāng)PHE顆粒沉積過(guò)多時(shí)，會(huì)發(fā)生團(tuán)聚，破壞了石墨烯的完整性，阻礙了電極上電子的傳遞，使峰電流減小。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇在沉積40圈條件下修飾得到的PHE/GPE[15]。從PHE/GPE在0.5～1.1 V電位掃描范圍內(nèi)測(cè)定20 μmol/L的CIT循環(huán)伏安圖(圖4B)中可以看出，在掃速?gòu)?0～100 mV的范圍內(nèi)，CIT在電極上的峰電流隨掃速的增加而增大。通過(guò)對(duì)掃速和其對(duì)應(yīng)峰電流的擬合，可以得出掃速的對(duì)數(shù)和峰電流的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系(圖4C)，線性方程為：logIp(μA)=0.5576logv(V/s)-0.9287(R2=0.9928)，斜率接近0.5，說(shuō)明CIT在此電極上的氧化反應(yīng)是一個(gè)受擴(kuò)散控制的過(guò)程[28]。

圖4 (A)沉積PHE時(shí)的掃描圈數(shù)對(duì)修飾電極的影響；(B)PHE/GPE在含有20 μmol/L CIT的0.1 mol/L PBS(pH=9.0)中在掃速為10～100 mV/s下的循環(huán)伏安(CV)圖；(C) B圖的峰電流的對(duì)數(shù)和掃速的對(duì)數(shù)的線性擬合圖Fig.4 (A) Effect of cycle number toward the depositon of PHE on GPE;(B) CVs obtained at PHE/GPE in 0.1 mol/L PBS(pH=9.0) containing 20 μmol/L CIT at scan rates from 10 to 100 mV/s;(C) The plot of logv vs.logIp

支持電解質(zhì)的pH值對(duì)CIT在PHE/GPE電極上響應(yīng)具有很大的影響。如圖5A所示，當(dāng)pH值增大時(shí)，CIT的峰電位隨之負(fù)移，且峰電位PBS的pH值呈線性關(guān)系(圖5B)，線性方程為：Ep=1.3868-0.0533pH，斜率為-53.3 mV/pH，接近理論值59 mV/pH，說(shuō)明CIT在電極上的反應(yīng)是一個(gè)質(zhì)子與電子轉(zhuǎn)移數(shù)相等的過(guò)程[29 - 30]。在不同pH值的條件下，CIT的峰電流大小也不盡相同(圖5C)，我們發(fā)現(xiàn)在pH=9.0的條件下，峰的形狀和峰電流都達(dá)到最優(yōu)。因此，本實(shí)驗(yàn)我們選擇在pH=9.0的條件下檢測(cè)CIT。

圖5 (A) PHE/GPE在含有20 μmol/L CIT的0.1 mol/L PBS中的循環(huán)伏安(CV)圖(掃速為0.025 V/s)；(B)pH值在6～10變化時(shí)峰電流與pH的線性擬合圖；(C)峰電流隨pH的變化關(guān)系Fig.5 (A) CVs obtained at PHE/GPE in 0.1 mol/L PBS containing 20 μmol/L CIT(scan rate is 0.025 V/s)；(B) The plot of pH vs.Epa；(C) the plot of Ip vs.pH

2.4 檢出限和檢出范圍

在攪拌條件下每50 s向0.1 mol/L PBS中連續(xù)滴加CIT。圖6A為在恒電位0.9 V的條件下，CIT在PHE/GPE上的計(jì)時(shí)電流曲線，從圖中可以看出，在0.5～15 μmol/L和15～88 μmol/L的范圍內(nèi)，響應(yīng)電流與CIT濃度呈分段線性關(guān)系(圖6B)，線性方程分別為：I(μA)=0.04322c(μmol/L))+0.05927(R2=0.9884)；I(μA)=0.0031c(μmol/L)+0.6519(R2=0.9775)。檢出限(S/N=3)為0.044 μmol/L。與文獻(xiàn)中的其他方法相比，本方法檢出限較低，線性范圍較寬(表1)。

圖6 (A)恒電位0.90 V下PHE/GPE對(duì)CIT的計(jì)時(shí)電流曲線(0.1 mol/L PBS，pH=9.0)，CIA濃度范圍0.5～88 μmol/L;(B)CIT氧化電流與濃度的線性關(guān)系Fig.6 (A)Typical amperometric responses of PHE/GPE to successive additions of several concentrations of CIT(from 0.5 to 88 μmol/L) at applied potential of 0.90 V in 0.1 mol/L PBS(pH=9.0);(B) The calibration plot of currents obtained at PHE/GPE against concentrations of CIT

表1 PHE/GPE與其它西酞普蘭傳感器的一些參數(shù)比較Table 1 Comparison of the analytical parameters of the PHE/GPE sensor with some other sensors for determination of citalopram

2.5 PHE/GPE電極的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和干擾實(shí)驗(yàn)

通過(guò)計(jì)時(shí)電流法來(lái)檢測(cè)PHE/GPE的抗干擾能力。如圖7A所示，在0.9 V的恒電位下，加入CIT響應(yīng)電流會(huì)有明顯變化，加入L-纈氨酸、KCl、腺嘌呤、NaCl、Na2SO4、葡萄糖時(shí)響應(yīng)電流均無(wú)明顯變化，再加入CIT時(shí)仍有響應(yīng)，說(shuō)明PHE/GPE對(duì)CIT有良好的選擇性。如圖7B所示，在0.9 V的恒電位條件下，加入50 μmol/L的CIT后，經(jīng)過(guò)90 min的電解，電流可以維持在初始值的90%以上，說(shuō)明該電極穩(wěn)定性較好。將此電極置于20 μmol/L的CIT溶液中連續(xù)測(cè)量10次，響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，說(shuō)明該電極的重現(xiàn)性良好。

圖7 (A)PHE/GPE對(duì)CIT、100 μmol/L L-纈氨酸、1 000 μmol/L KCl、100 μmol/L腺嘌呤、1 000 μmol/L NaCl、1 000 μmol/L Na2SO4和1 000 μmol/L葡萄糖的安培響應(yīng)；(B)恒電位0.90 V下PHE/GPE對(duì)20 μmol/L CIT的 0.1 mol/L PBS的安培響應(yīng)Fig.7 (A)Amperometric response of PHE/GPE to the addition of CIT,100 μmol/L L-valine,1 000 μmol/L KCl,100 μmol/L Adenine,1 000 μmol/L NaCl,1 000 μmol/L Na2SO4 and 1 000 μmol/L glucose；(B)Amperometric responses of PHE/GPE with 20 μmol/L CIT in 0.1 mol/L PBS at the potential of 0.90 V

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

將草酸艾司西酞普蘭片配制成濃度為10 μmol/L和15 μmol/L的溶液，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)四份草酸艾司西酞普蘭溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如表2所示，回收率在96.4%～104.8%之間，說(shuō)明PHE/GPE可以用于實(shí)際樣品中CIT的測(cè)定。

表2 西酞普蘭藥片的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本文通過(guò)高分子支撐法，將CVD法制得的石墨烯轉(zhuǎn)移到柔性PET基底上制成GPE，并通過(guò)電化學(xué)方法將PHE沉積在GPE表面得到PHE/GPE。該電極具備石墨烯的高導(dǎo)電性等良好的電化學(xué)性質(zhì)，以及PHE的生物活性和催化能力，能夠?qū)IT進(jìn)行精確的檢測(cè)。本方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、抗干擾能力強(qiáng)，以及制備簡(jiǎn)單、成本低廉等特點(diǎn)，檢出限(S/N=3)達(dá)到0.044 μmol/L，可以對(duì)實(shí)際樣品中CIT進(jìn)行檢測(cè)，有望廣泛應(yīng)用于電化學(xué)傳感器領(lǐng)域。柔性PET基底還使電極有望應(yīng)用于便攜乃至可穿戴傳感器的開(kāi)發(fā)。