熊果酸/甘草次酸-尿嘧啶核苷綴合物的合成與抗腫瘤活性評價

孫 立，初相伍，劉春梅，張琚政，程克光*

(1.省部共建藥用資源化學與藥物分子工程國家重點實驗室(廣西師范大學)，廣西 桂林 541004；2.廣西師范大學 化學與藥學學院，廣西 桂林 541004)

腫瘤疾病的發(fā)病率不斷上升，其死亡率僅次于心血管疾病[1]。手術和化療仍是主要的有效治療手段，但具有預后性差和毒副作用大的缺點，因此開發(fā)新型的具有靶向性的抗腫瘤候選藥物是當今抗腫瘤藥物研究的熱點[2-3]。將具有抗腫瘤活性的藥效團與某種具有靶向性的物質結合獲得新的抗腫瘤藥物是目前研究者慣用的一種手段[4]。

核苷與大多數生物的生長、遺傳和變異息息相關，如核酸和蛋白質的合成、酶的調控、新陳代謝等。近年來，核苷及其衍生物在抗病毒、抗腫瘤等方面得到了廣泛的發(fā)展[5-6]，研究發(fā)現尿嘧啶核苷衍生物可以有效作為半乳糖轉移酶抑制劑；5′-酰胺基尿嘧啶核苷衍生物是三磷酸核苷二磷酸水解酶-2(NTPDase2)的抑制劑[7-8]。一些核苷類似物已被應用于臨床，如5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟鐵龍(doxifluridine)、卡培他濱(capecitabine)、吉西他濱(gemcitabine)等。

近30年來，有近一半市售的新藥是天然產物或天然產物的衍生物[9-10]。五環(huán)三萜類化合物在自然界中分布廣泛，是很多常用中草藥的有效成分，具有廣泛的生物活性，如降血糖血脂、抗炎、抗腫瘤、抗HIV、抗病毒等[11]，還具有調節(jié)耐藥性和增加化療藥物敏感性的功能[12]。因此，以五環(huán)三萜作為抗腫瘤藥物的先導化合物的研究越來越多。熊果酸(UA)和甘草次酸(GA)都是典型的五環(huán)三萜化合物。研究發(fā)現，用聚乙二醇修飾的熊果酸衍生物增強了熊果酸的水溶性并且提高了它的體外抗癌活性[13]，熊果酸A環(huán)衍生物和羧酸酯化衍生物對Hep G2、SGC7901腫瘤細胞的抑制作用均強于母體熊果酸[14]。熊果酸對人慢性髓原白血病細胞(K562)通過增加Caspase-3的活性，上調凋亡促進因子Bax的表達，下調BCR/ABL中的酪氨酸酶的活性，從而誘導細胞凋亡[15]。甘草次酸的C3位羥基、C30位羧基經結構修飾的衍生物對MCF-7和A549癌細胞表現出明顯高于對照藥吉非替尼的抑制活性[16]。

本課題組前期研究顯示，齊墩果酸-尿嘧啶核苷綴合物具有較好的抗腫瘤活性，活性最好的化合物其IC50低于0.1 μmol/L[4]。為了探索其他五環(huán)三萜與尿嘧啶核苷綴合后的抗腫瘤活性，本文以具有抗腫瘤活性的天然產物熊果酸和甘草次酸為母體，設計、合成了4個熊果酸/甘草次酸-尿嘧啶核苷綴合物，并對它們進行了初步的體外抗腫瘤活性研究。如圖1所示，分別以熊果酸和甘草次酸為原料，在K2CO3堿性條件下，經二溴烷烴酯化，獲得溴代烷烴酯化合物1a～4a[17-18]；然后與尿嘧啶核苷發(fā)生親核取代反應，得熊果酸/甘草次酸-尿嘧啶核苷衍生物1b～4b。采用MTT法[19]對合成的目標物1b～4b進行體外抗腫瘤活性測試。

n表示亞甲基的數目圖1 熊果酸/甘草次酸-尿嘧啶核苷綴合物的合成Fig.1 Synthesis of uridine-UA/GA conjugates

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AV-500和AV-300 超導核磁共振儀、Esquire HCT 型離子阱質譜儀、HCT 電噴霧質譜(美國Bruker 公司)；RY-1熔點測定儀(天津天分分析儀器廠)；DLSB-5/20型低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長城科工貿有限公司)；AG 22331 Hamburg離心機(德國Eppendorf公司)；LX51顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；M1000酶標儀(瑞士帝肯集團公司)。

所有化學合成用原料均為化學純或分析純試劑；胰蛋白酶消化液、RPMI-1640、胎牛血清、DMSO、PBS等均購于阿法埃莎(天津)化學有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 化合物1a～4a的制備

將熊果酸(0.50 g，1.09 mmol)溶于DMF(5 mL)中，加入K2CO3(0.15 g, 1.09 mmol)和1,6-二溴己烷(0.84 mL, 5.47 mmol)，30 ℃下攪拌反應12 h。濃縮反應液，殘余物分散在乙酸乙酯(50 mL)中，依次用1 mol/L HCl、飽和NaHCO3和飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，濾液蒸除溶劑得粗產物。硅膠柱層析分離(petroleum ether∶EtOAc=3∶1，體積比，下同)得化合物1a[17-18](0.61 g, 產率90.0%, 白色固體)。

將熊果酸(2.00 g, 4.38 mmol)和1,8-二溴辛烷(2.40 mL, 13.14 mmol)同法操作，硅膠柱層析分離(petroleum ether∶EtOAc=4∶1)，得化合物2a[17-18](2.30 g, 產率81.0%, 白色固體)。

將甘草次酸(2.00 g, 4.25 mmol)和1,6-二溴己烷(3.24 mL, 21.25 mmol)同法操作，硅膠柱層析分離(petroleum ether∶EtOAc=5∶2)，得化合物3a[18,20](2.37 g, 產率88.0%, 白色固體)。

將甘草次酸(2.00 g, 4.25 mmol)和1,8-二溴辛烷(3.24 mL, 21.25 mmol)同法操作，硅膠柱層析分離(petroleum ether∶EtOAc=5∶2)，得化合物4a[18,20](2.42 g, 產率86.0%, 白色固體)。

1.2.2 化合物1b～4b的制備

將化合物1a(0.40 g, 0.65 mmol)溶于DMF(6 mL)中，加入K2CO3(0.27 g, 1.94 mmol)和尿嘧啶核苷(0.47 g, 1.94 mmol)，50 ℃下攪拌反應過夜。減壓旋除溶劑，殘余物用水(50 mL)分散，乙酸乙酯(20 mL×3)萃取，合并有機層，依次用HCl、飽和NaHCO3、飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，濾液濃縮，所得殘留物經硅膠柱層析分離純化(petroleum ether∶EtOAc=1∶10)得化合物1b(0.26 g, 產率52.8%，白色固體)。m.p.120～122 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3)：0.74, 0.78, 0.85 (d, 3H,J=6.4 Hz, CH3), 0.92 (d, 3H,J=3.8 Hz, CH3), 0.95, 0.99, 1.07 (5 s, each 3H, 5×CH3), 0.79～2.10 (m, 30H), 2.20 (d, 1H,J=11.1 Hz, H-18), 3.22 (dd, 1H,J=5.0, 10.7 Hz, H-3), 3.80～4.43 (m, 10H, H-2″, H-3″, H-4″, H-5″, OH, COOCH2, NCH2), 5.23 (s, 1H, H-12), 5.63 (d, 1H,J=4.3 Hz, NCHO), 5.76 (d, 1H,J=8.1 Hz, CCH=), 7.60 (d, 1H,J=8.1 Hz, NCH=)。13C NMR (75 MHz, CDCl3)15.3, 15.6, 16.9, 17.0, 18.2, 21.1, 23.2, 23.4, 24.1, 25.5, 26.3, 27.0, 27.3, 27.9, 28.1, 28.2, 30.6, 32.9, 36.7, 36.9, 38.5, 38.6, 38.8, 39.0, 39.5, 40.9, 42.0, 47.4, 48.0, 52.8, 55.1, 61.7, 64.0, 70.3, 74.8, 79.0, 85.4, 93.3, 101.8, 125.5, 138.1, 138.8, 151.5, 162.5, 177.9。HRMS (ESI)(m/z):[M+Na]+calcd for C45H70N2O9Na 805.497 9, found 805.498 6。

將化合物2a(0.40 g, 0.63 mmol)和尿嘧啶核苷(0.46 g, 1.89 mmol)同法操作，硅膠柱層析分離(petroleum ether∶EtOAc=1∶10)，純化得化合物2b(0.16 g, 產率31.6%, 白色固體)。m.p. 106～108 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3): 0.74, 0.78, 0.85 (d, 3H,J=6.5 Hz, CH3), 0.92, 0.94 (d, 3H,J=6.3 Hz, CH3), 0.98, 1.07 (5 s, each 3H, 5×CH3), 0.79～2.10 (m, 34H), 2.22 (d, 1H,J=12.1 Hz, H-18), 2.54 (s, 1H, OH), 3.22 (dd, 1H,J=10.4, 5.4 Hz, H-3), 3.32 (s, 1H, OH), 3.81～4.37 (m, 10H, H-2″, H-3″, H-4″, H-5″, OH, COOCH2, NCH2), 5.23 (s, 1H, H-12), 5.63 (d,J=3.6 Hz, 1H, NCHO), 5.75 (d, 1H,J=8.1 Hz, CCH=), 7.60 (d, 1H,J=8.1 Hz, NCH=)。HRMS (ESI) (m/z):[M+Cl]-calcd for C47H74N2O9Cl 845.508 3, found 845.509 3。

將化合物3a(0.40 g, 0.63 mmol)和尿嘧啶核苷(0.46 mg, 1.90 mmol)同法操作，硅膠柱層析分離(petroleum ether∶EtOAc = 1∶10)，純化得化合物3b(0.23 g, 產率46.4%, 白色固體)。m.p.120～122 ℃。1H NMR (300 MHz,CDCl3)：0.80, 1.00, 1.12 (s, 6H, 2×CH3), 1.13, 1.14, 1.37 (5 s, each 3H, 5×CH3), 0.67～2.34 (m, 27H), 2.35 (s, 1H, H-9), 2.75 (d, 1H,J=13.5 Hz, H-18), 3.23 (s, 1H, OH), 3.36 (s, 1H, OH), 3.45 (d, 1H,J=3.4 Hz, H-3), 3.82～4.60 (m, 10H, H-2″, H-3″, H-4″, H-5″, OH, COOCH2, NCH2), 5.63 (s, 1H, H-12), 5.72 (d, 1H,J=8.1 Hz, CCH=), 5.79 (d, 1H,J=4.7 Hz, NCHO), 7.77 (d, 1H,J=8.1 Hz, NCH=)。HRMS (ESI) (m/z): [M+Na]+calcd for C45H68N2O10Na 819.477 2, found 819.479 9。

將化合物4a(0.40 g, 0.62 mmol)和尿嘧啶核苷(0.45 mg, 1.85 mmol)同法操作，硅膠柱層析分離(petroleum ether∶EtOAc=1∶10)，純化得化合物4b(0.12 g, 產率45.3%, 白色固體)。m.p.104～106 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3): 0.80, 1.00, 1.14, 1.33, 1.36 (5 s, each 3H, 5×CH3), 1.12 (s, 6H, 2×CH3), 0.64～2.35 (m, 31H), 2.35 (s, 1H, H-9), 2.73 (d, 1H,J=13.4 Hz, H-18), 3.01 (s, 1H, OH), 3.22 (d, 1H,J= 3.0 Hz, H-3), 3.50 (s, 1H, OH), 3.81～4.38 (m, 10H, H-2″, H-3″, H-4″, H-5″, OH, COOCH2, NCH2), 5.64 (s, 1H, H-12), 5.75 (d, 1H,J=8.1 Hz, CCH=), 5.71 (d, 1H,J=3.0 Hz, NCHO), 7.69(d, 1H,J=8.1 Hz, NCH=)。HRMS (ESI) (m/z): [M+Na]+calcd for C47H72N2O10Na 847.508 5, found 847.509 5。

1.3 化合物的抗腫瘤活性測試

以相應溶劑作空白對照，5-氟尿嘧啶為陽性藥物， HepG2(人肝癌細胞株)、A549(人肺癌細胞株)、HeLa(人宮頸癌細胞株)、BGC-823(人胃腺癌細胞株)、NCI-H460(人肺癌細胞株)、BEL-7404(人肝癌細胞株)、HL-7702(人正常肝細胞)等7株細胞為測試細胞株，用MTT 法對目標化合物進行體外抗腫瘤活性測試。所有細胞株均培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、 CO2體積分數5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞對數生長期。將待測化合物以DMSO助溶后，使用PBS緩沖液配成1 000、500、100、50、10和1 μmol·L-1的工作液，存放于4 ℃冰箱保存，供測試受試化合物對所選腫瘤細胞株的IC50值使用。

取處于對數生長期狀態(tài)良好的細胞一瓶，加入質量分數0.25%胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細胞脫落，計數2×104～4×104個/mL，制成細胞懸液；取細胞懸液接種于96孔板上，180 μL/孔，置恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；換液，加入受試化合物，20 μL/孔，培養(yǎng)72 h；將MTT加入96孔板中，20 μL/孔，培養(yǎng)箱中反應4 h；吸去上清液，加入DMSO，100 μL/孔，平板搖床上振搖10 min；用酶聯免疫檢測儀在波長為570 nm處測定每孔的吸光值，并計算細胞抑制率(細胞抑制率=(陰性對照組OD值-受試藥物組OD值)/陰性對照組OD值×100%)，測得各受試化合物的體外抗腫瘤細胞增殖活性數據。表1為20 μmol/L測試化合物對不同腫瘤細胞株的抑制率及其IC50。

表1 測試化合物對不同腫瘤細胞株的IC50 和抑制率

2 結果分析與討論

從表1數據可知，甘草次酸-尿嘧啶核苷類綴合物3b和4b對HepG-2和A549的抑制作用強于熊果酸-尿嘧啶核苷類綴合物1b和2b。熊果酸-尿嘧啶核苷類綴合物中，化合物2b對Hep-G2的抑制活性相對強一些，但同時毒性較強，對正常細胞HL-7702具有明顯抑制作用。甘草次酸-尿嘧啶核苷類衍生物3b和4b對HepG-2具有一定的抑制作用，對正常細胞HL-7702也有一定毒性。熊果酸/甘草次酸-尿嘧啶核苷類化合物對BGC-823表現出較好的抑制作用，其中4b的活性最好，抑制率達到64.2%。此外，化合物2b對HeLa的作用較好，抑制率達到53.6%。

3 結論

因前期研究表明齊墩果酸-尿嘧啶核苷綴合物具有較好的抗腫瘤活性[4]，本文進一步合成了4個熊果酸/甘草次酸-尿嘧啶核苷綴合物，并對它們進行了體外抗腫瘤活性測試?；钚詼y試結果表明，熊果酸/甘草次酸-尿嘧啶核苷衍生物具有一定的抗腫瘤活性，但遠不如前期研究工作中的齊墩果酸-尿嘧啶核苷衍生物的抗腫瘤活性。