血清miR-107在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)及其診斷價(jià)值分析*

張肖麗，李炳慶，張?jiān)聲裕R月雯，陳 健

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,河北承德 067000)

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道腫瘤，在我國全部惡性腫瘤中，結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率均處于第五位[1]。手術(shù)是結(jié)直腸癌治療的首選方法，在疾病早期接收了手術(shù)治療的患者可獲得較好的預(yù)后，然而多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)[2]。因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療是提高結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)鍵。微小RNA(miRNA)是長約22 nt的單鏈非編碼RNA，具有廣泛的生物學(xué)功能，已有多種miRNA有望成為結(jié)直腸癌的新的診斷生物標(biāo)記物，如miR-21、miR-92[3]、miR-103[4]等。miR-107位于人類第10號染色體，已有研究證實(shí)其參與了胃癌[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]的發(fā)生、發(fā)展，然而miR-107在結(jié)直腸癌中的具體作用尚不清楚，還有待相關(guān)研究進(jìn)行驗(yàn)證。本研究旨在探討miR-107在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系，并進(jìn)一步分析了miR-107聯(lián)合癌胚抗原(CEA)、糖類抗原199(CA199)對結(jié)直腸癌的早期診斷價(jià)值，現(xiàn)將研究結(jié)果整理報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本次研究通過了本院倫理委員會的批準(zhǔn)。隨機(jī)選取2016年1月至2019年1月于本院腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)并經(jīng)病理確診的結(jié)直腸癌患者60例作為結(jié)直腸癌組[8]，男40例，女20例，年齡48～72歲，平均(56.97±6.21)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)入組前均未接受放化療和手術(shù)治療；(2)臨床資料完整；(3)患者及其家屬對本次研究均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他惡性腫瘤者；(2)伴有心、肝、腎等重要臟器功能不全者；(3)結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)病例；(4)伴有嚴(yán)重精神疾病患者。另選取同期在本院接受治療的60例結(jié)直腸息肉患者作為息肉對照組，所有病例均經(jīng)臨床、影像學(xué)或病理學(xué)診斷為結(jié)直腸息肉[9]，男34例，女26例，年齡45～70歲，平均(55.89±7.31)歲。另選取同期在本院體檢的健康志愿者60例作為健康對照組，男32例，女28例，年齡46～74歲，平均(56.12±9.34)歲。3組研究對象的性別、年齡等比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1血清miR-107檢測 抽取3組研究對象的空腹靜脈血5 mL，以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min后，將上層血清分裝于無酶的離心管中，置于-80 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。用Trizol提取總RNA，分光光度計(jì)(A260/A280)檢測RNA的濃度和純度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測miR-107的相對表達(dá)量，miR-107正向引物：5′-ACA CTC CAG CTG GGA GCA GCA TTG TAC AG-3′，反向引物：5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA-3′；U6正向引物：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CAT ATA CT-3′，反向引物：5′-CGA ATT TGC GTG TCA TCC TTG CG-3′，反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 20 s(此步驟收集熒光信號)，45個(gè)循環(huán)；60 ℃～95 ℃進(jìn)行溶解曲線分析。采用2-ΔΔCt計(jì)算miR-107相對表達(dá)量，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2血清CEA、CA199檢測 采用全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(羅氏公司的Roche EleesysE601)及其配套試劑檢測血清CEA、CA199的水平。

1.3觀察指標(biāo) 比較3組研究對象的血清miR-107相對表達(dá)量及測血清CEA、CA199的水平；分析結(jié)直腸癌患者血清miR-107的相對表達(dá)量與患者臨床病理特征的關(guān)系；分析血清miR-107、CEA、CA199對直結(jié)腸癌的診斷價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.13組研究對象血清miR-107相對表達(dá)量以及血清CEA、CA199水平比較 3組研究對象的血清miR-107相對表達(dá)量以及血清CEA、CA199水平整體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)直腸癌組的血清miR-107相對表達(dá)量以及血清CEA、CA199水平高于息肉對照組和健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，息肉對照組和健康對照組的血清miR-107相對表達(dá)量以及血清CEA、CA199水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2血清miR-107相對表達(dá)量與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌患者血清miR-107的表達(dá)量與性別、年齡、腫瘤最大徑無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

注：與健康對照組比較，aP<0.05；與息肉對照組比較，bP<0.05。

表2 血清miR-107相對表達(dá)量與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3血清miR-107、CEA、CA199對結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值分析

2.3.1各指標(biāo)單獨(dú)應(yīng)用對結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值 以結(jié)直腸癌組為陽性樣本，息肉對照組為陰性樣本，再將miR-107、CEA、CA199等3指標(biāo)水平劃分成7～8個(gè)組段，建立ROC診斷分析模型。結(jié)果顯示，miR-107、CEA、CA199的ROC-AUC分別為0.882、0.793、0.741，見表3。ROC分析曲線見圖1。

2.3.23項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用對結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值 仍采用本研究樣本資料。以該3項(xiàng)指標(biāo)各自的閾值為診斷閾值，對各樣本做陰性或陽性判斷。若3項(xiàng)指標(biāo)均為一致陽性或陰性時(shí)做出樣本的陽或陰性診斷，有一個(gè)指標(biāo)不一致時(shí)則對其進(jìn)行復(fù)測，復(fù)測未改變時(shí)即認(rèn)可另兩指標(biāo)的診斷結(jié)果，并同步與臨床醫(yī)師會商。如此計(jì)算得：血清miR-107、CEA、CA19聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌的靈敏度和特異度分別為0.917(55/60)和0.867(52/60)，見表3。

圖1 血清miR-107、CEA、CA199診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線圖

表3血清miR-107、CEA、CA199對結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值分析

檢測指標(biāo)AUCAUC 95%CI理論閾值靈敏度(%)特異度(%)約登指數(shù)miR-1070.8820.814～0.9509.20.8500.8290.679CEA0.7930.712～0.8742.5 ng/mL0.7620.7810.543CA1990.7410.662～0.8209.8 U/mL0.7380.7120.440聯(lián)合應(yīng)用--以上各自閾值0.9170.8670.784

注：聯(lián)合應(yīng)用的靈敏度和特異度為實(shí)測計(jì)算；單獨(dú)應(yīng)用則為理論(平滑模擬)計(jì)算；-表示無數(shù)據(jù)。

3 討 論

結(jié)直腸癌是我國常見癌癥之一，相關(guān)報(bào)道顯示[10]，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率分別占全球的18.6%和20.1%，均居位列第一，且近年來我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率一直處于上升的趨勢，給患者家庭及社會均帶來了沉重的疾病負(fù)擔(dān)[11]。由于結(jié)直腸癌起病隱匿，患者在疾病早期無明顯的特異性癥狀，進(jìn)展到中晚期時(shí)，患者才出現(xiàn)腹痛、便血、腸梗阻等癥狀，導(dǎo)致該疾病的早期診斷較為困難[12]。目前尚欠缺特異度高、敏感度強(qiáng)的檢測指標(biāo)可作為結(jié)直腸癌的腫瘤標(biāo)記物，CEA是首先從結(jié)腸癌和胚胎組織中提取的一種腫瘤相關(guān)抗原，在結(jié)直腸癌預(yù)后的評估中發(fā)揮重要作用，是臨床監(jiān)測結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的常用指標(biāo)[13]；CA199是一種黏蛋白型的糖類蛋白腫瘤標(biāo)志物，在胰腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中呈高表達(dá)[14]。張鑫東等[15]的研究顯示，血清CEA和CA199水平升高均為結(jié)直腸癌患者預(yù)后不佳的危險(xiǎn)因素。CEA、CA199也可用于結(jié)直腸癌的早期診斷，但其靈敏度和特異度均不高，因此尋找理想的特異度高、敏感度強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物成為臨床研究的重點(diǎn)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[16]，在游離的血清、血漿等循環(huán)體液中存在豐富穩(wěn)定的miRNA，臨床可通過檢測循環(huán)體液中的miRNA水平來進(jìn)行腫瘤的診斷及預(yù)后分析，由于血液標(biāo)本獲取方便，血清、血漿中的miRNA對惡性腫瘤的診斷作用越來越受到臨床的重視。

miR-107是一種新發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤密切相關(guān)的miRNA，趙軻等[17]、羅振國等[18]的研究顯示，miR-107在非小細(xì)胞肺癌患者血漿、前列腺癌患者血清中呈高表達(dá)，且有相關(guān)研究結(jié)果顯示[19]，miR-107可用于評估結(jié)直腸癌患者的化療療效，另FEN等[20]的研究結(jié)果顯示，miR-107在結(jié)直腸癌的癌組織和細(xì)胞株中均呈高表達(dá)。在本次研究中，直腸癌患者血清中miR-107明顯高于結(jié)腸直腸息肉患者和健康人群血清中的水平，且進(jìn)一步的研究證明，結(jié)直腸癌患者血清miR-107與腫瘤的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這提示miR-107可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)展，F(xiàn)EN等[20]通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明miR-107可直接靶向前列腺凋亡反應(yīng)基因4(PAR-4)，抑制PAR-4的表達(dá)，進(jìn)而起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。王智宇等[21]的研究證實(shí)，miR-107通過調(diào)控Let-7、Dicer的表達(dá)增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移。

本研究ROC曲線分析提示血清miR-107診斷結(jié)直腸癌的靈敏度和特異度分別為0.850和0.829，約登指數(shù)為0.679，ACU為0.882，診斷價(jià)值高于血清CEA和CA199，提示血清miR-107有望成為結(jié)直腸癌診斷的新的標(biāo)記物。且血清miR-107聯(lián)合CEA、CA199進(jìn)行早期診斷，則診斷價(jià)值還可進(jìn)一步提高，其聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌的靈敏度和特異度分別為0.917和0.867，約登指數(shù)為0.784，可見3個(gè)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用較之于各指標(biāo)單獨(dú)應(yīng)用，可使診斷效能得到明顯的提升。

4 結(jié) 論

miR-107在結(jié)直腸癌患者血清中水平較結(jié)腸直腸息肉患者和健康人群高，且與腫瘤的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，血清miR-107對結(jié)直腸癌有較高的診斷價(jià)值，且和CEA、CA199聯(lián)合檢測可進(jìn)一步提高診斷效能。然而本研究選取病例數(shù)較少，且為單中心研究，以上結(jié)論還有待更多的研究進(jìn)行證實(shí)。miR-107可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，本研究已初步證實(shí)其對結(jié)直腸癌有較高的診斷價(jià)值，在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步分析miR-107在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制及其能否用于結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評估。miR-107在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)異常升高，且其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，對其進(jìn)行檢測利于結(jié)直腸的早期診斷，有望成為結(jié)直腸癌新的生物標(biāo)志物。