血清miR-155聯(lián)合組織PTEN檢測對子宮內(nèi)膜癌的診斷價值*

陳玉芬，張秀俊，蘇海飛，張 肖，韓 敏

(1.邯鄲市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北邯鄲 056002；2.館陶縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北邯鄲 057750)

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，約占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，屬于最常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤之一。近年來，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率呈上升趨勢，并有年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅著婦女生活質(zhì)量和生命健康。在臨床診斷中，常通過觀察患者陰道排液增多或不規(guī)則出血等現(xiàn)象來判斷子宮內(nèi)膜癌發(fā)病，但診斷存在不準(zhǔn)確性，大多數(shù)患者在診斷出患子宮內(nèi)膜癌疾病時已是晚期階段，預(yù)后效果極差，病死率高[1]。微小RNA(miRNA)是一種非蛋白編碼的小分子RNA，通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)發(fā)揮作用[2]。有研究表明，miR-155與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病密切相關(guān)[3]。人第10號染色體缺失的磷酸酶(PTEN)是目前已知唯一具有脂質(zhì)磷酸酶活性的抑癌基因且PTEN是子宮內(nèi)膜癌中突變率最高的基因[4]。有研究表明PTEN是miR-155的靶基因，miR-155通過調(diào)控PTEN表達(dá)參與肝癌、胃癌等惡性腫瘤中發(fā)生[5]。因此本研究通過觀察子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-155表達(dá)、組織PTEN蛋白表達(dá)情況，探討二者應(yīng)用于早期預(yù)測子子宮內(nèi)膜癌的可能性，為臨床診斷、治療子宮內(nèi)膜癌提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年6月至2018年6月邯鄲市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的子宮內(nèi)膜癌患者51例，包括不典型增生5例，Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌46例，年齡45～70歲，平均(55.29±4.39)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：均存在明確手術(shù)指征；經(jīng)病理學(xué)檢查明確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌；臨床資料不完整者。另選取同期良性病變患者52例，包括子宮內(nèi)膜息肉38例，單純性增生9例，復(fù)雜性增生3例，不規(guī)則增殖2例，年齡48～71歲，平均(56.21±5.12)歲，所有研究對象檢查前均未經(jīng)放化療以及激素治療。

1.2方法

1.2.1熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)法檢測血清中miR-155表達(dá)量 入院后所有研究對象空腹采取靜脈血5 mL，避免溶血，4 ℃ 3 500 r/min條件下冷凍離心20 min，小心吸取上清液，貼好標(biāo)簽后-80 ℃貯藏備用，避免反復(fù)凍融。按照Trizol試劑盒說明書操作提取血清總RNA，按照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBR Green RCR master mix試劑說明配反應(yīng)體系并加樣。完成后將其放入熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，程序設(shè)定為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設(shè)計見表1。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt算法，以U6為內(nèi)參基因，計算miR-155相對表達(dá)量。

表1 Q-PCR引物序列

1.2.2免疫組化法檢測子宮內(nèi)膜癌組織中PTEN蛋白表達(dá) 子宮內(nèi)膜組織用石蠟包埋制作石蠟切片，切片厚4 μm并采用免疫組化SP法染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，DAB(二氨基聯(lián)苯氨)顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，采用蘇木素復(fù)染并將其在不同梯度乙醇中脫水，中性樹脂進(jìn)行封片，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。在200倍光鏡下觀察結(jié)果并從每個切片中選取10個高倍視野中隨機挑選并對陽性染色細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。PTEN以細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性表達(dá)，采用組織化學(xué)評分(H-Score)系統(tǒng)半定量分析，H-Score=Σpii，式中pi表示陽性細(xì)胞數(shù)量占切片中所有細(xì)胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù)；i代表著色強度。細(xì)胞中無黃色出現(xiàn)為0分，細(xì)胞中出現(xiàn)較淺的陽性染色但弱于間質(zhì)細(xì)胞為1分，細(xì)胞中出現(xiàn)中等程度的陽性染色等于間質(zhì)細(xì)胞為2分，細(xì)胞中出現(xiàn)強陽性染色強于間質(zhì)細(xì)胞為3分。陽性細(xì)胞數(shù)少于5%記0分；5%～25%記1分；>26%～50%記2分；>50%～75%記3分；>75%記4分?？偡?～120分。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清miR-155表達(dá)情況 與良性病變組相比，子宮內(nèi)膜癌組血清miR-155表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2子宮內(nèi)膜癌組織及良性病變組織中PTEN蛋白表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示PTEN在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，染色呈淺黃色、棕黃色、棕褐色，著色顯著、均勻。見圖1。與良性病變組相比，子宮內(nèi)膜癌組PTEN蛋白表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 兩組miR-155表達(dá)水平的檢測結(jié)果

2.3血清miR-155、組織PTEN表達(dá)水平對子宮內(nèi)膜癌的診斷價值 ROC曲線顯示，血清miR-155水平預(yù)測患者子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的曲線下面積為0.876，截斷值為2.06，靈敏度為96.3%，特異度為94.2%。組織PTEN水平預(yù)測患者子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的曲線下面積為0.952，截斷值為53.00，靈敏度為94.1%，特異度為92.3 %。見圖2。

注：a為PTEN陰性表達(dá)，b為PTEN陽性表達(dá)。

圖1子宮內(nèi)膜癌組織及良性病變組織中PTEN蛋白表達(dá)情況(×200)

圖2 血清miR-155、組織PTEN水平對子宮內(nèi)膜癌的預(yù)測價值

表3聯(lián)合檢測logistic回歸分析

指標(biāo)BSEwalddfSigORmiR-1553.2700.94312.03110.00126.314PTEN0.0690.02012.28810.0001.071聯(lián)合預(yù)測-13.9683.90312.80510.0000.000

2.4血清miR-155聯(lián)合組織PTEN檢測對子宮內(nèi)膜癌的預(yù)測作用 經(jīng)logistics回歸分析，設(shè)X1=miR-155，X2=PTEN，得到子宮內(nèi)膜癌預(yù)測概率值回歸方程P=1/[1+]，在SPSS中生成預(yù)測值的新變量Pre-1。ROC曲線顯示，二者聯(lián)合檢測診斷子宮內(nèi)膜癌曲線下面積為0.991，靈敏度為99.2%，特異度為92.5%。見表3。

3 討 論

臨床按照病理組織學(xué)特點可將子宮內(nèi)膜癌分為子宮內(nèi)膜樣癌(Ⅰ型)和非子宮內(nèi)膜樣癌(Ⅱ型)，其中80%～90%的病例屬于子宮內(nèi)膜樣癌。多發(fā)生于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女。在我國，隨著社會的發(fā)展和經(jīng)濟條件的改善，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年上升，目前僅次于宮頸癌，居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位。陰道排液異常是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的典型性狀，早期可表現(xiàn)為稀薄的白色分泌物或少量血性白帶，如果合并感染或癌灶壞死，可有膿性分泌物伴有異味，有時陰道排液中可伴有組織樣物。但只依靠陰道排液診斷子宮內(nèi)膜癌準(zhǔn)確性低，大多數(shù)患者在診斷出患子宮內(nèi)膜癌疾病時已是中晚期階段，錯過了治療的最佳時期，因此尋求預(yù)測子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的有效標(biāo)志物顯得尤為重要。

miR-155是一個典型的多功能miRNA，位于非編碼區(qū)基因Bic內(nèi)，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究表明miR-155在肺癌、乳腺癌和胰腺癌等組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)[6-8]。YANOKURA等[9]通過對正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織表達(dá)的667種miRNA進(jìn)行基因篩選發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜相比miR-155存在明顯異常表達(dá)。高玲等[10]研究表明miR-155在子宮內(nèi)膜癌組織中存在異常表達(dá)，上調(diào)子宮內(nèi)膜癌患者miR-155表達(dá)能促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖和削弱子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的凋亡能力，推測在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中，miR-155可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因Caspase3對細(xì)胞增殖與凋亡產(chǎn)生影響。陳玉芬等[11]研究表明miR-155可作為輔助預(yù)測子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的標(biāo)記物。本研究通過qRT-PCR技術(shù)得知，miR-155在子宮內(nèi)膜癌患者血清內(nèi)表達(dá)顯著高于子宮良性病變患者，與相關(guān)研究相符，猜測miR-155與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。ROC曲線顯示，血清miR-155水平對子宮內(nèi)膜癌的早期診斷作用曲線下面積為0.876，截斷值為1.46，表明當(dāng)血清miR-155表達(dá)量高于1.46時，患子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險增加，然而靈敏度、特異度一般，提示miR-155可作為子宮內(nèi)膜癌的輔助檢查，不能直接預(yù)測子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。

PTEN是一種抑癌基因，由在1997年原發(fā)性乳腺癌患者組織中首次獲得，定位于人10q 23.3染色體上，含有9個外顯子和8個內(nèi)含子，可通過調(diào)控細(xì)胞分裂周期，阻止細(xì)胞過快生長、分裂[12]。有證據(jù)顯示，PTEN蛋白還有協(xié)助抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、細(xì)胞與周圍組織的黏附和血管發(fā)生等功能[13]。劉丙營[14]研究發(fā)現(xiàn)隨著子宮內(nèi)膜癌病情加重，PTEN陽性表達(dá)率逐級減少，提示PTEN陽性表達(dá)率與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。SHAFIEE等[15]研究表明，PTEN是miR-155的靶基因，miR-155可調(diào)控PTEN參與細(xì)胞增殖、遷移過程。本研究中，經(jīng)免疫組化半定量分析得知，PTEN在子宮內(nèi)膜癌患者癌組織內(nèi)表達(dá)顯著低于子宮良性病變患者，猜測PTEN可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。ROC曲線顯示，PTEN水平對子宮內(nèi)膜癌的診斷作用曲線下面積為0.952，靈敏度為94.1%，特異度為92.3%，診斷價值較高，截斷值為135，提示患者PTEN水平低于135時發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險較高，且診斷價值較高，與相關(guān)研究相符[16-18]。此外本研究通過Logistic得到血清miR-155、組織PTEN水平聯(lián)合預(yù)測回歸方程，得到一組新變量，即P=1/[1+]，聯(lián)合診斷子宮內(nèi)膜癌曲線下面積為0.991，靈敏度為99.2%，特異度為92.5%，靈敏度、特異度均高于血清miR-155、組織PTEN水平單一檢測，表明二者聯(lián)合進(jìn)一步提高診斷子宮內(nèi)膜癌的靈敏度與特異度，有望成為子宮內(nèi)膜癌的早期診斷指標(biāo)。

4 結(jié) 論

血清miR-155、組織PTEN聯(lián)合檢測對子宮內(nèi)膜癌的診斷效率優(yōu)于單獨檢測，有助于提高診斷的準(zhǔn)確性與科學(xué)性。本研究也存在一定不足，樣本數(shù)量過少，需進(jìn)一步擴大樣本量，相關(guān)機制也有待進(jìn)一步研究。