清香風(fēng)味導(dǎo)向的釀酒酵母Y2的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

賈麗艷 田宇敏 荊 旭 韓 英 王 愈 杜小威

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷 030801

2 山西杏花村汾酒廠股份有限公司 山西汾陽 032209

3 山西白酒生物工程研究生教育創(chuàng)新中心 山西太谷 030801）

汾酒作為清香型白酒的代表，以其優(yōu)良品質(zhì)在國內(nèi)外享有盛名[1]。汾酒生產(chǎn)仍沿用傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式，以高粱、豌豆、大麥為主料，谷糠、稻殼為輔料，通過開放式的操作方式網(wǎng)羅區(qū)域自然環(huán)境中的多種微生物，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、蒸餾、勾兌而成[2-3]。經(jīng)過長期自然馴化及汾酒獨(dú)特的工藝條件，使得汾酒酒醅中形成了一個(gè)彼此共生、依次消長和代謝互補(bǔ)的特定微生物群落，包括霉菌、酵母菌、細(xì)菌等多種微生物。這些微生物及其代謝產(chǎn)物在酒醅的液化、糖化、酒化、酯化過程中發(fā)揮了重要作用，賦予了汾酒獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)[4-7]。汾酒酒醅是一個(gè)天然優(yōu)質(zhì)的微生物菌種資源庫。酒醅菌種資源的開發(fā)利用，對(duì)于白酒的純種發(fā)酵、強(qiáng)化發(fā)酵或定向發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義。

清香型白酒的主體香味成分是乙酸乙酯和乳酸乙酯，占總酯的95%以上，其中乙酸乙酯占總酯的55%以上，具有清爽的果香味[8]。它的含量高低直接影響清香型白酒的質(zhì)量和風(fēng)格[9-11]。傳統(tǒng)發(fā)酵白酒中酯香成分的含量波動(dòng)較大，特別是夏季發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，由于環(huán)境溫度高、濕度大，酒醅中乳酸菌含量高，易導(dǎo)致原料出酒率低，白酒中乳酸乙酯濃度相對(duì)偏高，而主體香乙酸乙酯含量相對(duì)較低，使酒體香味失去平衡，產(chǎn)生白酒生產(chǎn)上的“掉排”現(xiàn)象。為此，提高清香型白酒中乙酸乙酯含量，降低乳酸乙酯相對(duì)含量（“增乙降乳”），提高出酒率，預(yù)防白酒生產(chǎn)的“掉排”現(xiàn)象，成為夏季清香型白酒生產(chǎn)中亟需解決的問題。

本研究采用風(fēng)味導(dǎo)向的方法，從汾酒酒醅中篩選高產(chǎn)乙酸乙酯的白酒釀造功能性菌株；基于形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征及26S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析的微生物分類鑒定技術(shù)，鑒定菌株；通過對(duì)其生物學(xué)特性及在清香型白酒發(fā)酵過程中的應(yīng)用效果，說明該菌株的應(yīng)用前景，為清香型白酒的純種發(fā)酵或強(qiáng)化發(fā)酵提供優(yōu)質(zhì)菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料和菌株

酒醅：發(fā)酵 7，15，23 d的酒醅。

白酒釀酒酵母Y0：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

選擇培養(yǎng)基：孟加拉紅選擇培養(yǎng)基，北京路橋公司。

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，蛋白胨1 g，酵母提取物 1 g，蒸餾水 100mL，自然 pH值，121℃，0.1 MPa 滅菌20min[12]。

發(fā)酵液：將含糖量為67.88%的糖漿用蒸餾水稀釋，使發(fā)酵液起始糖度為22°Bx，121℃蒸餾20 min，備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母菌的分離 將酒醅混勻，稱取10 g放入已滅菌的裝有生理鹽水90mL的三角瓶中，28℃恒溫水浴培養(yǎng)30min，混勻，10倍倍比稀釋至10-5。分別取100μL倍比稀釋液涂布于孟加拉紅選擇培養(yǎng)基上，靜置20min，待稀釋液被吸收后，28℃倒置培養(yǎng)48 h，待菌落長出后，選擇酵母菌菌落特征明顯的單菌落，進(jìn)一步劃線2～3次，以獲得純菌落。將純化的疑似酵母菌落轉(zhuǎn)入YPD固體斜面，4℃保存，備用。

1.3.2 酵母的篩選 將分離篩選的菌株接種于YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，以3%的接種量分別接種于發(fā)酵液，28℃恒溫培養(yǎng)7 d。采用氣相色譜技術(shù)測(cè)定，并比對(duì)酵母發(fā)酵液中揮發(fā)性成分，篩選產(chǎn)清香香氣成分的酵母。

1.3.3 酵母26S rDNA的PCR擴(kuò)增及序列的測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析 酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)域序列擴(kuò)增引物為NL1（5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′）和NL4（5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′），序列的測(cè)定由上海生工完成。待測(cè)菌株26S rDNA序列測(cè)序完成后，將得到的序列登陸http//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank進(jìn)行BLAST，選取數(shù)據(jù)庫中有代表性的菌株26S rDNA，采用clustalx1.83軟件的Multiple Sequence Alignment程序進(jìn)行同源性序列比對(duì)；采用MEGA5.1軟件，以鄰接法（Neighbour-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap=1000）[13]。

1.3.4 菌株耐受性研究

1.3.4.1 酒精耐受性試驗(yàn) 向含酒精分別為0%，6%，8%，10%，12%，14%的YPD液體培養(yǎng)基中接入3%新鮮發(fā)酵的酵母液，28℃培養(yǎng)，以未接種的YPD液體培養(yǎng)基做空白對(duì)照，每隔12 h，觀察發(fā)酵液的混濁程度，有無白色沉淀產(chǎn)生，考察其酒精耐受性。

1.3.4.2 溫度耐受性試驗(yàn) 向YPD液體培養(yǎng)基中接入3%新鮮發(fā)酵的酵母液，分別置于28，30，33，36，39，42，45℃下恒溫培養(yǎng)，以未接種的YPD液體培養(yǎng)基做空白對(duì)照，每隔12 h，觀察發(fā)酵液的混濁程度及有無白色沉淀的產(chǎn)生，考察其溫度耐受性。

1.3.4.3 酸耐受性試驗(yàn) 用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)YPD 培養(yǎng)基pH值為1.5，2.0，2.5，3.0。接入3%新鮮發(fā)酵的酵母液，28℃恒溫培養(yǎng)，以未接種的YPD液體培養(yǎng)基做空白對(duì)照，每隔12 h，觀察發(fā)酵液的混濁程度及有無白色沉淀產(chǎn)生，考察其酸耐受性。

1.3.4.4 糖耐受性試驗(yàn) 向分別含葡萄糖15%，17%，18%，19%的YPD液體培養(yǎng)基中接入3%新鮮發(fā)酵的酵母液，28℃恒溫培養(yǎng)，以未接種的YPD液體培養(yǎng)基做空白對(duì)照，每隔12 h觀察發(fā)酵液的混濁程度及有無白色沉淀產(chǎn)生，考察其糖耐受性。

1.3.5 菌株在清香型固態(tài)白酒發(fā)酵過程中的應(yīng)用 以清香型白酒大楂發(fā)酵并蒸餾后的糟醅為原料，添加1%的酵母菌株、10%清香型白酒生產(chǎn)用曲，厭氧發(fā)酵50 d，測(cè)定酒醅理化指標(biāo)后蒸餾酒醅，獲得白酒，測(cè)定白酒香氣骨架成分。以清香型白酒正常發(fā)酵二楂酒為正常對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離

根據(jù)酵母菌的菌落特征及菌體的鏡檢結(jié)果，從發(fā)酵7 d和15 d的酒醅中分離篩選出16株酵母，分別為Y1，Y2……Y16。

2.2 產(chǎn)清香味菌株篩選

通過嗅覺對(duì)比不同酵母發(fā)酵液揮發(fā)性物質(zhì)的氣味，發(fā)現(xiàn)酵母Y2發(fā)酵液比其它酵母發(fā)酵液產(chǎn)生的清香味濃郁。通過氣相色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該酵母Y2可產(chǎn)生653mg/L乙酸乙酯，比其它酵母菌株產(chǎn)乙酸乙酯能力均高（圖1），同時(shí)發(fā)現(xiàn)菌株Y2出酒率能達(dá)到10.5%（V/100 g），表明菌株Y2是一株兼具高產(chǎn)乙酸乙酯和酒精功能的菌株。

圖1 不同酵母發(fā)酵液揮發(fā)性骨架成分Fig.1 The volatile component skeleton on fermentation liquid of different yeast

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌落及菌體形態(tài)特征菌株Y2在YPD培養(yǎng)基上菌落為白色，表面光滑，中間厚，邊緣薄，邊緣與中央顏色一致，邊緣整齊；菌體為橢圓形，單向出芽產(chǎn)生子細(xì)胞（圖2）；產(chǎn)3枚光滑的卵圓形子囊孢子。

圖2 菌株Y2的菌落及菌體特征Fig.2 Character on micrographic and colony of strain Y2

2.3.2 生理生化特性 表1為菌株Y2的碳源發(fā)酵和同化試驗(yàn)結(jié)果。由表1可知，菌株Y2可以發(fā)酵或同化利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、海藻糖和棉籽糖等，不能發(fā)酵或同化利用乳糖、L-阿拉伯糖、可溶性淀粉、纖維二糖、鼠李糖、檸檬酸、山梨醇和乙醇等。

表1 菌株Y2的碳源利用Table1 The usage on carbon source of strain Y2

2.3.3 26 S rDNA的Dl/D2序列分析 以菌株Y2的總DNA為模板，使用NL1和NL4一對(duì)引物擴(kuò)增菌株Y2的26S rDNA近5’端的D1/D2序列并測(cè)序。將序列登陸 http：//www.genbank.com進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示菌株Y2與釀酒酵母具有很高的序列相似性，達(dá)到100%。以粟酒裂殖酵母（Saccharomyces mikatae）菌株為外群，通過多序列比對(duì)，以鄰接法構(gòu)建進(jìn)化。結(jié)果表明，菌株Y2與釀酒酵母種中各菌株的遺傳距離較近，而與酵母屬中其它酵母的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，如奇異釀酒酵母（Saccharomyces paradoxus）、庫德里阿茲威酵母（Saccharomyces kudrisvzevii）。

綜合菌株Y2的菌落、菌體特征、培養(yǎng)特征及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將其初步確定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖3 依據(jù)26S rDNA基因序列構(gòu)建的菌株Y2系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 26S rDNA sequence of strain Y2

2.4 菌株Y2的耐受性

2.4.1 酒精耐受性 乙醇是釀酒酵母菌發(fā)酵的重要產(chǎn)物，然而也是酵母菌細(xì)胞的抑制劑，菌株的乙醇耐受力與乙醇產(chǎn)率密切相關(guān)，可以將其作為篩選高產(chǎn)乙醇酵母的一個(gè)參考依據(jù)[14]。菌株Y2的酒精耐受性見表2，當(dāng)酒精度在10%～12%之間時(shí)，培養(yǎng)12 h，發(fā)酵液變混濁并產(chǎn)生大量氣泡，表明菌株Y2可快速生長，酒精度不影響菌株Y2的生長；當(dāng)酒精度達(dá)到14%時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長發(fā)酵液逐漸混濁，且有微量氣泡產(chǎn)生，表明菌株Y2的生長受到抑制，生長緩慢；當(dāng)酒精度達(dá)到16%時(shí)，培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液仍保持清亮，表明菌株Y2生長受到酒精度的抑制。由上可知，菌株Y2的最高耐受酒精度為14%。

2.4.2 溫度耐受性 溫度直接影響酵母菌的生長繁殖和老化。溫度較高時(shí)，可以促進(jìn)酵母菌生長繁殖，加速其老化；如果溫度太高，則會(huì)直接抑制酵母生長。不同酵母對(duì)溫度的耐受性不同。菌株Y2的溫度耐受性見表2，當(dāng)溫度在28～36℃時(shí)，培養(yǎng)12 h，發(fā)酵液變混濁并產(chǎn)生大量氣泡，表明菌株Y2可快速生長，該溫度適合菌株Y2生長；當(dāng)溫度達(dá)到39℃時(shí)，發(fā)酵液隨發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸混濁，且有微量氣泡產(chǎn)生，表明菌株Y2生長受到影響，生長緩慢；當(dāng)溫度達(dá)到42℃時(shí)，培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液仍保持清亮，表明菌株Y2生長受溫度抑制。由上可知，菌株Y2的最高耐受溫度為39℃。

2.4.3 酸耐受性 在酒醅的發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酒醅的pH值逐漸降低。若要繼續(xù)發(fā)揮酵母的生理功能，必須具有一定的耐酸性。菌株Y2的pH耐受性結(jié)果見表2，當(dāng)pH值為2.5～3.5時(shí)，培養(yǎng)12 h，發(fā)酵液變混濁并產(chǎn)生大量氣泡，表明菌株Y2快速生長，該pH值范圍適合菌體的生長；當(dāng)pH值為2時(shí)，發(fā)酵液隨發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸混濁，且有微量氣泡產(chǎn)生，表明菌株Y2生長受到影響，生長緩慢；當(dāng)pH值達(dá)到1.5時(shí)，培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液仍保持清亮，表明菌株Y2生長受pH值抑制。由上可知，菌株Y2的最高耐受的pH值為2。

2.4.4 糖耐受性菌株Y2的糖度耐受性結(jié)果見表2。當(dāng)糖度為15%～19%時(shí)，培養(yǎng)12 h，發(fā)酵液變混濁，并產(chǎn)生大量氣泡，表明菌株Y2生長快速，該糖度適合Y2的生長；當(dāng)糖度達(dá)到18%時(shí)，發(fā)酵液逐漸混濁，且有微量氣泡產(chǎn)生，表明菌株Y2生長受到影響，生長緩慢；當(dāng)糖度達(dá)到19%時(shí)，培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液保持清亮，表明菌株Y2生長受抑制。由上可知，菌株Y2的最高耐受糖度為18%。

表2 菌株Y2的環(huán)境耐受性Table2 The tolerance on strain Y2

2.5 菌株Y2在清香型白酒發(fā)酵過程中的應(yīng)用

2.5.1 菌株Y2強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)酒醅的影響菌株Y2強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)酒醅的影響見圖4，菌株Y2強(qiáng)化酒醅發(fā)酵提高了酒醅的酒精度，表明菌種強(qiáng)化發(fā)酵有利于提高酒醅的出酒率。此外酒醅中的殘淀粉含量、還原糖含量較正常發(fā)酵對(duì)照組高，而酸度較低，這有利于酒醅蒸餾酒后丟糟的利用。此外，酒醅還具有撲鼻的果香味或乙酸乙酯味。

2.5.2 菌株Y2強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)清香型白酒理化指標(biāo)及主要風(fēng)味物質(zhì)的影響 香氣物質(zhì)種類及含量影響清香型白酒的風(fēng)味，其中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量變化對(duì)白酒影響較大[15]。菌株Y2強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)白酒理化指標(biāo)及主要風(fēng)味物質(zhì)的影響結(jié)果，見表5。菌株Y2強(qiáng)化發(fā)酵組出酒率大于正常對(duì)照組；菌株強(qiáng)化發(fā)酵組乙酸乙酯含量為9.54 g/L，占到了總酯類含量的96.95%，與正常對(duì)照組相比，乙酸乙酯含量提高了2.5倍，總酯含量提高了64%，乙酸乙酯/乳酸乙酯比值提高至14.70，表明該酒為高乙酸乙酯、高乙酸乙酯/乳酸乙酯比的白酒，該酒適合用于勾調(diào)夏季乳酸乙酯偏高的基酒。此外，研究發(fā)現(xiàn)菌株Y2強(qiáng)化發(fā)酵酒總酸含量高，是對(duì)照組的1.62倍，可以作為清香型白酒高酸調(diào)味酒，以增加白酒的綿柔感。

圖4 菌種Y2強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)酒醅的影響Fig.4 The effect on strain Y2 to the Jiupei

表3 菌種Y2強(qiáng)化發(fā)酵蒸餾酒理化指標(biāo)及主要風(fēng)味物質(zhì)Table3 The physical and chemical index and the main flavor substance of Baijiu fermented by strain Y2 and Daqu

2.5.3 菌株Y2強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)清香型白酒感官品質(zhì)的影響 國家級(jí)品酒師10人對(duì)菌種Y2強(qiáng)化發(fā)酵蒸餾白酒進(jìn)行品評(píng)，一致認(rèn)為菌株Y2強(qiáng)化發(fā)酵白酒具有清香、糟香、酯香，帶醬感，落口酸爽、醇厚、綿柔，乙酸乙酯香突出的特點(diǎn)，適合用做清香型白酒的調(diào)味酒，以增加成品酒的酯香、糟香、醬香、醇厚綿柔感。

3 結(jié)論

通過嗅覺聞香和氣相色譜分析，篩選得到一株出酒率高且產(chǎn)較高乙酸乙酯的菌株Y2，該菌株在糖漿發(fā)酵液中28℃培養(yǎng)7 d，可產(chǎn)乙酸乙酯653 mg/L，發(fā)酵液酒精度可達(dá)10.5%。經(jīng)菌落形態(tài)觀察及分子生物學(xué)方法鑒定，確定該菌株為釀酒酵母。該酵母具有良好的環(huán)境耐受性，最高耐受溫度為39℃；耐酸性好，在pH 2.0的條件下能夠生長；耐酒精能力強(qiáng)，最高耐受酒精度為14%（V/V）；耐糖性好，可耐受葡萄糖含量為18%。

菌株Y2可用于發(fā)酵清香型白酒，生產(chǎn)的白酒具有清香、糟香、酯香，帶醬感，落口酸爽、醇厚、綿柔，乙酸乙酯香突出的特點(diǎn)，可作為清香型白酒的調(diào)香酒。