藍(lán)舌病病毒蛋白結(jié)構(gòu)與檢測(cè)方法研究進(jìn)展

史衛(wèi)軍 ， 黃超華 ， 曹琛福 ， 林彥星 ， 王 瀟 ， 花群義

(1.深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 ， 廣東 深圳 518045 ； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 廣東 廣州 510642)

藍(lán)舌病(Bluetongue, BT)是由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起，經(jīng)庫(kù)蠓、伊蚊等媒介昆蟲(chóng)傳播感染反芻動(dòng)物的烈性非接觸性傳染病。1876年首次在南非被發(fā)現(xiàn)[1],1906年Theiler正式命名為“藍(lán)舌病”，將引起該病的病毒命名為藍(lán)舌病病毒[2]。20世紀(jì)初，伴隨國(guó)際貿(mào)易的發(fā)展，BT隨后傳入美洲、亞洲、歐洲等地，中國(guó)1979年首次發(fā)現(xiàn)該病的存在。BTV主要引起綿羊發(fā)病和死亡，牛和山羊常為隱性感染，反芻動(dòng)物感染后平均死亡率為35%，易感綿羊死亡率可高達(dá)80%[3-4]。藍(lán)舌病的分布與中間宿主的活動(dòng)范圍有很大關(guān)系，大致分布在北緯40°和南緯45°區(qū)域之間，一些地區(qū)在北緯50°內(nèi)也檢測(cè)到BTV，這種分布情況的改變可能與全球氣候變暖有關(guān)。藍(lán)舌病因分布范圍廣、危害大，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為須法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，中國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病[5]，也是我國(guó)出入境口岸重點(diǎn)檢疫的外來(lái)動(dòng)物疾病。本文簡(jiǎn)述了藍(lán)舌病病毒蛋白結(jié)構(gòu)及診斷方法，旨在為進(jìn)一步研究病毒和新的檢測(cè)方法提供參考。

1 病毒結(jié)構(gòu)

BTV是呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)藍(lán)舌病病毒亞群(Bluetonguevirussub-group)的成員。完整的BTV粒子為圓形、無(wú)囊膜的二十面立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，核衣殼直徑為53～60 nm，加上衣殼外細(xì)絨毛狀層，總直徑為70～80 nm，是目前分子質(zhì)量最大的RNA病毒[6]。迄今為止，全世界范圍內(nèi)共分離到27種不同血清型的BTV[7]，不同的血清型之間無(wú)交叉保護(hù)作用[8]。有研究表明，相繼在中東和南非檢測(cè)到28型和29型BTV[9]。我國(guó)引起藍(lán)舌病的主要病原為1型和16型。

BTV由10個(gè)大小不等的雙鏈RNA基因片段組成，其分段基因組RNA3′和5′端各含有特異的重復(fù)保守序列，為5′-GUUAAA 和3′-ACUUAC[10]。10個(gè)獨(dú)立的RNA片段分別命名為L(zhǎng)1～3、M4～6、S7～10，可編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～7)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1～4)。除S10節(jié)段外每個(gè)節(jié)段只編碼一種蛋白[11]。BTV具有雙層衣殼結(jié)構(gòu)，最外層由VP2(111 kDa)和VP5(59 kDa)構(gòu)成，核心衣殼由VP3(100 kDa)和VP7(38 kDa)2種主要結(jié)構(gòu)蛋白和VP1(149 kDa)、VP4(76 kDa)、VP6(36 kDa)3種次要結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成。4種非結(jié)構(gòu)蛋白可能參與了BTV的復(fù)制、“裁剪”和運(yùn)輸，是在被BTV感染的細(xì)胞中合成的[12]。

2 病毒蛋白

2.1 外衣殼蛋白VP2、VP5 VP2和VP5構(gòu)成包裹BTV核心顆粒的外層衣殼，約占BTV總蛋白量的40%。外殼蛋白在病毒吸附靶細(xì)胞和進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，研究發(fā)現(xiàn)，除去VP2或VP2及VP5后的BTV核心顆粒對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞不具有感染能力，但對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞更具感染性。

VP2由L2基因編碼，位于病毒粒子的最外層，是病毒的主要型特異性抗原和血凝素蛋白，BTV的血清型特異性抗原決定簇主要存在于VP2中。VP2由950～960個(gè)氨基酸組成，不同血清型之間氨基酸序列變化范圍為22.7%～72.9%，各血清型缺乏有效交叉免疫保護(hù)。相同血清型不同地域不同毒株的VP2蛋白的核苷酸序列，最大的差異可以達(dá)到30%。VP2蛋白能與宿主細(xì)胞表面的血型糖蛋白A結(jié)合，參與病毒的吸附和進(jìn)入，缺失VP2的病毒不能結(jié)合細(xì)胞，也不具有感染細(xì)胞的能力。VP2可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，并對(duì)同一血清型病毒產(chǎn)生免疫保護(hù)。

VP5由M5基因編碼，以三聚體形式整齊分布在病毒粒子表面，大小為526個(gè)氨基酸。VP5也是型特異性抗原，但更加保守，不同血清型BTV間同源性為70%以上，產(chǎn)生的中和抗體具有群特異性，在一定程度上可以反映病毒的地域來(lái)源。VP5與病毒的毒力有關(guān)，調(diào)節(jié)病毒粒子從內(nèi)吞泡釋放到細(xì)胞質(zhì)，增強(qiáng)細(xì)胞膜透性化。VP5在VP2免疫中和反應(yīng)中起增強(qiáng)作用，對(duì)研究BT疫苗具有重要意義。

2.2 內(nèi)衣殼蛋白VP3和VP7 VP3和VP7是BTV核衣殼的2種主要蛋白，與3種次要蛋白共同組成包裹基因組的內(nèi)層衣殼，保持著B(niǎo)TV核心結(jié)構(gòu)的完整性。

VP3由L3基因編碼，位于病毒衣殼最內(nèi)層，有903個(gè)氨基酸殘基，高度保守，屬群特異性抗原。VP3蛋白分為A和B兩種構(gòu)型，2種構(gòu)型形成閉合的亞核芯層結(jié)構(gòu)，為VP7三聚體的附著提供了支架。亞核芯層同時(shí)與內(nèi)部的VP1、VP4、VP6及dsRNA緊密結(jié)合，在維持病毒核芯顆粒結(jié)構(gòu)的完整性起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，VP3與BTV的毒力無(wú)關(guān)。

VP7由S7基因碼編，以三聚體的形式存在于VP3蛋白表面，大小為349個(gè)氨酸基，至少有2個(gè)表位暴露，是BTV主要的血清群特異性抗原，在病毒的復(fù)制和傳播中起重要作用。位于VP7蛋白255處的賴氨酸殘基對(duì)病毒內(nèi)衣殼的形成起著必不可少的關(guān)鍵作用[13]。VP7在不同血清型中具有高度保守性和較強(qiáng)的抗原性，26種不同血清型中其氨基酸殘基的同源性達(dá)到98%。細(xì)胞被BTV感染后，VP7是最早被檢測(cè)出的抗原，動(dòng)物被感染后，VP7抗體也是機(jī)體產(chǎn)生的主要抗體之一，所以VP7是建立BTV群特異性血清學(xué)檢測(cè)方法的最佳抗原[14]。在缺乏VP2或VP5的情況下，VP7也可介導(dǎo)BTV對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞吸附和侵入。

2.3 核芯蛋白VP1、VP4、VP6 VP1、VP4、VP6三種核芯蛋白與內(nèi)衣殼蛋白和10條基因組共同組成BTV核心顆粒。3種核芯蛋白具有酶活性，參與轉(zhuǎn)錄及加帽裝飾等過(guò)程。

VP1由L1基因編碼，長(zhǎng)1 302個(gè)氨酸基，是BTV蛋白質(zhì)中最大的蛋白，分子重量為149.5 kDa，但在病毒粒子中占的比列很少，每個(gè)病毒粒子中大約只有12個(gè)拷貝。VP1具有RNA聚合酶活性，并對(duì)Mg2+具有依賴性，可以寡聚核苷酸A為引物延伸RNA的合成，并能作為BTV復(fù)制酶以正鏈RNA為模板合成雙鏈RNA。在27～37 ℃之間VP1的活性最大，能在昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物中進(jìn)行有效的復(fù)制。

VP4由M4基因編碼，長(zhǎng)654個(gè)氨基酸，主要作為鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶參與病毒mRNA的合成。早期的藍(lán)舌病病毒mRNA并不具有生物活性，需要加帽修飾才能使mRNA更穩(wěn)定和高效翻譯，參加這一裝飾過(guò)程的4種酶都需要VP4蛋白進(jìn)行催化。另外，VP4細(xì)長(zhǎng)的模塊化晶體結(jié)構(gòu)也為病毒粒子的有效裝配提供了支架[15]。

VP6由S9基因編碼，長(zhǎng)328個(gè)基氨酸。VP6免疫原性很強(qiáng)，但較保守，被認(rèn)為是一種群特異性抗原，可以誘導(dǎo)高滴度的特異性抗體產(chǎn)生。VP6還具有ATP結(jié)合活性，能展開(kāi)BTV的雙鏈并輔助mRNA的合成。

2.4 非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2、NS3、NS3A 和NS4 目前，在BTV感染的細(xì)胞中已經(jīng)檢測(cè)到4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a、NS4)。4種非結(jié)構(gòu)蛋白在不同血清型BTV之間保守性很強(qiáng)，它們?cè)诓《玖Ｗ拥慕M裝和運(yùn)輸過(guò)程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，非結(jié)構(gòu)蛋白在區(qū)分受BTV感染動(dòng)物和接種疫苗動(dòng)物鑒別診斷方面也具有很大潛力。

NS1由M6基因編碼，含有552個(gè)氨基酸，分子量64 kDa，是BTV最大的一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白,也是藍(lán)舌病病毒編碼的蛋白中表達(dá)量最高的。NS1在不同血清型的BTV之間高度保守，基因相似性達(dá)80%～90%，為一種型特異性抗原。電子顯微鏡下觀察被BTV感染的細(xì)胞，可以看到大量的病毒特異性小管(直徑52.3 nm，長(zhǎng)1 000 nm)組成的多聚體NS1蛋白。有試驗(yàn)證實(shí)，這些小管可以選擇性促進(jìn)BTV單鏈RNA的翻譯，增加病毒滴度[16]。研究發(fā)現(xiàn)，NS1的表達(dá)量可能會(huì)決定病毒的釋放方式，影響到病毒對(duì)細(xì)胞的損傷程度。

NS2由S8基因編碼，含有357個(gè)氨基酸，蛋白分子大小約為42 kDa。主要存在于被感染細(xì)胞的細(xì)胞核附近，聚集病毒基因組復(fù)制及核心組裝所需的病毒單鏈RNA和蛋白成分，形成病毒包涵體(VIBs)。NS2是BTV感染細(xì)胞中唯一確定的磷蛋白，具有良好的抗原性，可以與單鏈RNA結(jié)合，并可以使三磷酸核苷酸水解成單磷酸核苷酸。這表明NS2蛋白在病毒復(fù)制過(guò)程中起重要作用。

NS3由BTV基因組中長(zhǎng)度最小的S10基因編碼，S10基因有2個(gè)開(kāi)放閱讀框，分別編碼具有229個(gè)氨基酸的NS3(25.5 kDa)和216個(gè)氨基酸的NS3a(24 kDa)。NS3a與NS3相比，缺少了N端的13個(gè)氨基酸，兩者氨基酸序列及核苷酸序列都具有高度保守性，高達(dá)82%～99%，具有群抗原特異性。NS3在BTV復(fù)制和形成過(guò)程中在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生，先集聚在細(xì)胞高爾基體上，后轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞膜上以糖基化的膜蛋白存在。NS3/NS3A蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)較少，僅可以勉強(qiáng)檢測(cè)出來(lái)，但在昆蟲(chóng)細(xì)胞中具有很高的表達(dá)量，因此這2種蛋白可能的主要作用是參與了BTV在昆蟲(chóng)體內(nèi)的傳播。NS3是BTV編碼的唯一膜蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)具有2個(gè)跨膜螺旋，其氨基酸序列的118～148位點(diǎn)和156～181位點(diǎn)形成螺旋結(jié)構(gòu)跨越整個(gè)細(xì)胞膜。研究發(fā)現(xiàn)，NS3與VP2相互作用，通過(guò)招募ESCRT-I蛋白Tsg101來(lái)幫助病毒從感染細(xì)胞中釋放[17]。

NS4是2011年發(fā)現(xiàn)的一種新型非結(jié)構(gòu)蛋白，位于BTVS9基因上，與VP6的ORF相重疊，含有77～ 79個(gè)氨基酸殘基，分子量10 kDa，高度保守，NS4的N端富含堿性氨基酸，C端有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)[18]。試驗(yàn)證實(shí)，其在病毒感染早期表達(dá)，是復(fù)制非必需蛋白，具有非典型核定位信號(hào)，在干擾素應(yīng)答適應(yīng)性和小鼠致病性中扮演著重要角色[19]。

3 檢測(cè)方法

3.1 病原學(xué)檢測(cè) 病毒分離鑒定是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的藍(lán)舌病診斷方法之一。BTV可在10～11日齡雞胚、易感細(xì)胞(如蚊子細(xì)胞C6/36、倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK-21、非洲綠猴腎細(xì)胞Vero等)和綿羊身上增殖。雞胚接種與細(xì)胞培養(yǎng)相結(jié)合是目前分離BTV最敏感和有效的方法。我國(guó)BTV分離鑒定的方法主要依據(jù)《藍(lán)舌病診斷技術(shù)》(GB/T18636-2017)和《藍(lán)舌病病毒分離、鑒定及血清中和抗體檢測(cè)技術(shù)》(GB/T18089-2008)進(jìn)行，基本步驟為：病料采集及制備(全血、肝、脾、腎、淋巴結(jié)、精液、庫(kù)蚊)-雞胚靜脈接種-接種C6/36細(xì)胞-BHK21或Vero細(xì)胞盲傳3代以上-鑒定、定型。

3.2 血清學(xué)檢測(cè)

3.2.1 瓊脂糖免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID) AGID為最早推廣應(yīng)用的抗體檢測(cè)方法之一，也是OIE推薦使用的方法。1962年，Klontz最先應(yīng)用AGID檢測(cè)藍(lán)舌病病毒群特異性抗體，我國(guó)目前仍在使用該方法診斷藍(lán)舌病。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)用從BTV在BHK-21或Vero細(xì)胞培養(yǎng)物提取的可溶性抗原，與待檢血清在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性血清對(duì)照,室溫放置24 h后，有沉淀線出現(xiàn)的為藍(lán)舌病病毒抗體陽(yáng)性。該法簡(jiǎn)便易行，可以在沒(méi)有復(fù)雜實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件下對(duì)大量血清樣品進(jìn)行低成本檢驗(yàn)。缺點(diǎn)是靈敏性和特異性稍差，與環(huán)狀病毒及其他病毒如流行性出血病病毒(EHDV)等存在交叉反應(yīng)，容易受到抗原的水溶解性、決定簇?cái)?shù)量和分子量、抗原和抗體的比例、pH 值等不同條件的影響[20]。

3.2.2 血清中和試驗(yàn)(MTSN) 主要方法為將56 ℃滅活后的待檢血清倍比稀釋后與不同血清型BTV在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育，同時(shí)設(shè)平行組和對(duì)照組，72～168 h后通過(guò)觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)情況來(lái)判定結(jié)果，當(dāng)被檢血清孔50%出現(xiàn)保護(hù)的，判定為陽(yáng)性，該孔此時(shí)的血清稀釋度即為該份血清的中和抗體滴度。有人對(duì)自然感染動(dòng)物和人工接種動(dòng)物進(jìn)行了血清效價(jià)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)自然感染康復(fù)綿羊的中和抗體滴度可達(dá)1∶160以上，遠(yuǎn)高于人工接種綿羊。MTSN的特異性和敏感性較強(qiáng)，可用于BTV型特異性抗體的檢測(cè)及分離。不足是準(zhǔn)確性和測(cè)定效價(jià)會(huì)受細(xì)胞培養(yǎng)條件、培養(yǎng)液成分及細(xì)胞類型等因素影響。

3.2.3 過(guò)氧化物酶染色法(IPS) 該方法是利用標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)蛋白抗原，包括間接過(guò)氧化物酶檢測(cè)法(IP)、熒光抗體檢測(cè)法(FA)及過(guò)氧化物抗過(guò)氧化物酶檢測(cè)法(PAP)等3種方法。其中敏感性最高的是IP中以抗生物素及生物素的復(fù)合物標(biāo)記過(guò)氧化物酶為基礎(chǔ)的ABC- IP檢測(cè)方法，已在生產(chǎn)實(shí)踐中得到應(yīng)用。IPS缺點(diǎn)是制備抗原蛋白和相應(yīng)單克隆抗體操作繁瑣，無(wú)法長(zhǎng)期保存原材料。

3.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) ELISA是最常用的血清學(xué)檢測(cè)方法。20世紀(jì)80年代，國(guó)外已先后報(bào)道了BTV間接ELISA、阻斷ELISA、競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法的建立。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法為OIE推薦的BTV血清學(xué)診斷方法，也是檢測(cè)BTV最敏感的檢測(cè)方法，該方法主要使用抗NS1蛋白單抗和抗VP7蛋白單抗，可用來(lái)檢測(cè)任何感染動(dòng)物體內(nèi)的藍(lán)舌病抗體，且與其他環(huán)狀病毒不會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者以VP5、VP2、VP3、VP7、NS1、NS3等特異性抗原及基因表達(dá)抗原建立了不同的ELISA檢測(cè)方法，特異性和靈敏性都較高。ELISA方法具有特異性高、操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)少、結(jié)果便于觀察等優(yōu)點(diǎn)，所以目前被廣泛研究和應(yīng)用。

3.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

3.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)技術(shù)(PCR) PCR是一種快速的體外DNA片段擴(kuò)增技術(shù)，在BTV的血清型分類、核酸研究及病毒檢測(cè)上得到了廣泛應(yīng)用。PCR技術(shù)以藍(lán)舌病病毒mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到BTV片段，經(jīng)過(guò)限制性酶切后電泳進(jìn)行分析。目前采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和序列分析是用來(lái)進(jìn)行BTV檢測(cè)和鑒定非常有效的分子診斷技術(shù)，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，適用于感染早期病毒量少時(shí)的臨床檢測(cè)。采用巢式RT-PCR檢測(cè)血液和組織中的BTV已被OIE推薦為國(guó)際貿(mào)易采用方法，具有特異、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(FQ-PCR)利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在一定程度上實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè)的目的，其靈敏度及特異性高，操作簡(jiǎn)便快捷，缺點(diǎn)是易被擴(kuò)增抑制物抑制和出現(xiàn)假陽(yáng)性。

3.3.2 核酸分子雜交技術(shù) 核酸分子雜交技術(shù)是利用不同來(lái)源的DNA單鏈與RNA鏈彼此有互補(bǔ)的堿基序列而結(jié)合來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的病原核酸。在BTV核苷酸序列的檢測(cè)中，設(shè)計(jì)BTV cDNA探針，通常分子探針制備選取cDNA片段L2、L3、S7、M6，利用其與BTV病毒RNA進(jìn)行核酸雜交以檢測(cè)BTV抗原。盡管核酸分子雜交法具有敏感性強(qiáng)、特異性高、耗時(shí)短等特點(diǎn)，但過(guò)程十分繁瑣，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)技能要求也相對(duì)較高，并不適用于常規(guī)的病原檢測(cè)。

4 小結(jié)

藍(lán)舌病病毒是結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的RNA病毒之一，由多種病毒蛋白和多節(jié)段的RNA基因組構(gòu)成，有27種血清型，不同的血清型之間無(wú)交叉保護(hù)作用。近年來(lái)受全球氣候變暖及國(guó)際貿(mào)易的影響，藍(lán)舌病在全球呈現(xiàn)出擴(kuò)大的流行趨勢(shì)，病毒部分血清型的遺傳特性也在發(fā)生改變，導(dǎo)致病毒毒力改變、致病力增強(qiáng)，不僅造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也給研究和防治工作帶來(lái)了較大的挑戰(zhàn)性?？於鴾?zhǔn)的檢測(cè)是控制和消滅藍(lán)舌病的基礎(chǔ)，盡管現(xiàn)在已經(jīng)建立了許多BTV的檢測(cè)和鑒定方法，但仍存在檢測(cè)成本高、步驟繁瑣、周期長(zhǎng)、結(jié)果不穩(wěn)定、識(shí)別抗原單一等問(wèn)題，需要通過(guò)研究進(jìn)行完善和優(yōu)化。因此，了解藍(lán)舌病病毒結(jié)構(gòu)功能及檢測(cè)現(xiàn)狀，對(duì)于進(jìn)一步探索新的檢測(cè)方法和疫病防制都具有重要意義。