基于Fosmid 文庫平臺快速構(gòu)建PRV、PCV-2 和CSFV多聯(lián)疫苗及其應(yīng)用研究

隨著集約化、高密度養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，生豬養(yǎng)殖遭受各種傳染病暴發(fā)的困擾，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。其中豬偽狂犬病、豬瘟和豬圓環(huán)病毒病是危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要疾病，三者在臨床中常常混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國廣泛采用疫苗接種的方法來控制上述傳染病，為了降低免疫成本、減少免疫次數(shù)，研制“一針防多病”的多聯(lián)疫苗顯得格外重要。其中利用活病毒載體構(gòu)建同時表達(dá)多種抗原蛋白的多聯(lián)疫苗是抵抗傳染病混合感染的有效策略。研究證實(shí)，豬瘟病毒（CSFV）囊膜糖蛋白E2 和豬圓環(huán)病毒2 型（PCV-2）衣殼蛋白Cap 是其主要的抗原蛋白，而豬偽狂犬病病毒（PRV）gE/gI/TK 基因缺失疫苗安全性能高，能夠提供完全保護(hù)，因此，利用基因缺失PRV 開發(fā)多聯(lián)活病毒載體疫苗具有良好的應(yīng)用前景。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所仇華吉研究員團(tuán)隊在前期研究中建立了一種高效、靈活的基于Fosmid 文庫的遺傳操作平臺用于快速構(gòu)建重組PRV，為開展PRV 活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。

近期仇華吉研究團(tuán)隊在《Pathogens》上發(fā)表了題為“Generation and immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus co-expressing classical swine fever virus E2 protein and porcine circovirus type 2 capsid protein based on fosmid library platform”的研究論文，該研究以其團(tuán)隊前期建立的能夠快速構(gòu)建PRV 突變體的Fosmid 文庫平臺為基礎(chǔ)，構(gòu)建了表達(dá)CSFV E2 蛋白和PCV-2 衣殼蛋白的重組PRV，并進(jìn)行了免疫原性評價。

該研究首先利用Fosmid 文庫平臺構(gòu)建了共表達(dá)CSFV E2 蛋白和PCV-2 Cap 蛋白的gE/gI/TK 三基因缺失重組PRV，采用間接免疫熒光技術(shù)和免疫印跡法驗(yàn)證E2 和Cap 蛋白可在PK-15 細(xì)胞上高水平表達(dá)。重組病毒rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2-Cap 在pK-15細(xì)胞上傳代20 代后，其生長曲線與親本病毒rPRVTJ-delgE/gI/TK 無明顯差別，說明基因缺失和外源基因的插入對PRV 病毒粒子的形成和增殖能力無影響。分別以P5、P10、P15 和P20 代病毒的基因組為模板，PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證gE/gI/TK 基因的缺失及外源基因E2 和Cap 的存在，結(jié)果表明該重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性。在家兔和豬體的免疫評價結(jié)果表明，rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2-Cap 對家兔和豬是安全的，沒有引起任何PRV 特異性的臨床癥狀，且從免疫后家兔和豬只的血清中均能檢測出抗PRV 的抗體。然而，該重組病毒免疫后未能檢測到抗CSFV和PCV-2 的抗體，這可能是由于插入外源基因的位置不合適，或E2 和Cap 蛋白的表達(dá)量太低不足以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

本研究采用的Fosmid 文庫構(gòu)建方法為PRV 病毒活載體疫苗的開發(fā)提供了一個關(guān)鍵技術(shù)平臺，獲得的重組病毒rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2-Cap 經(jīng)進(jìn)一步的優(yōu)化設(shè)計后，有望作為一種新的三價候選疫苗用以對抗PRV、CSFV 和PCV-2 混合感染。同時本研究采用的策略為豬傳染病多聯(lián)疫苗的研制提供了新的思路。