基于iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜技術(shù)金槍魚內(nèi)臟脂質(zhì)組學研究

王海星 張燕平 李詩言 陳 康 饒 偉 沈 清

(1浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室,浙江工商大學海洋食品研究院,浙江杭州 310012；2浙江省麻醉重點實驗室,溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院,浙江溫州 325000；3浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心,浙江杭州 310023；4沃特世科技上海有限公司,上海 200120)

脂質(zhì)組學是對生物體、組織或細胞中的脂質(zhì)進行全面系統(tǒng)的鑒定分析,了解脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,進而揭示脂質(zhì)代謝與生物生理、病理關(guān)系的一門學科[1-5]。脂質(zhì)組學已成為國際研究熱點[6],現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品科學等多學科領(lǐng)域[7-10]。隨著對脂質(zhì)組學研究的逐漸深入[11],脂質(zhì)組學分析方法也越來越多元化[12-14]。但傳統(tǒng)脂質(zhì)組學分析方法中,樣品前處理過程耗時耗力,無法滿足高通量快速分析的需求。

iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜是一種無需任何樣品前處理,實時檢測樣品中目標化合物的一種新型敞開式電離質(zhì)譜技術(shù)[15]。iKnife智能設(shè)備基于電外科手術(shù)刀開發(fā),由高頻電刀和質(zhì)譜分析儀兩部分組成。與傳統(tǒng)手術(shù)電刀不同的是,該技術(shù)可在術(shù)中對組織樣品進行實時質(zhì)譜分析鑒定,iKnife用電燒灼組織過程中產(chǎn)生帶電氣溶膠,經(jīng)文丘里系統(tǒng)吸入質(zhì)譜端口并進行代謝物成分分析,從大數(shù)據(jù)中提取有用信息并將分析結(jié)果投射在觸摸屏監(jiān)控器上,該技術(shù)在國外主要應(yīng)用于醫(yī)學研究,可在手術(shù)過程中根據(jù)脂質(zhì)代謝物組成對腫瘤組織進行實時診斷識別[16-17]。

金槍魚,又名鮪魚、吞拿魚,素來以高營養(yǎng)、純天然、無污染而享譽國際,其肌肉富含蛋白質(zhì)、維生素、不飽和脂肪酸和必需礦物質(zhì)元素等[18-20],其中二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)2種多不飽和脂肪酸含量非常豐富[21]。近幾年,全世界金槍魚年產(chǎn)量穩(wěn)定在400萬t左右,產(chǎn)值達300多億美元,已成為我國海產(chǎn)品的主要補充和加工出口魚種[22]。金槍魚主要加工為生魚片[23]和各類罐藏食品[24],然而其可利用部分僅為50%～70%,內(nèi)臟等加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物由于缺乏先進的高值化加工技術(shù)而得不到較好的利用,大部分被當做飼料或直接丟棄[25]。

本研究擬優(yōu)化iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜參數(shù),建立實時脂質(zhì)組學技術(shù)方法對金槍魚內(nèi)臟中磷脂成分進行研究,探索金槍魚內(nèi)臟的營養(yǎng)價值,深入研究金槍魚副產(chǎn)物的脂質(zhì)代謝物組成,以期為金槍魚副產(chǎn)物的快速質(zhì)譜分析檢測及綜合利用提供重要的科學依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、丙二醇,色譜純,購自美國Merck公司；亮氨酸腦啡肽,美國Sigma公司；試驗用超純水；金槍魚內(nèi)臟組織樣品,浙江興業(yè)集團有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Xevo G2-XS四極桿飛行時間質(zhì)譜儀,配有特制的iKnife智能手術(shù)刀(SJ350B),北京東方神鍵醫(yī)療器械有限公司；REIMS質(zhì)譜進樣接口,英國Waters公司,試驗裝置如圖1所示；Pump11 elite針泵注射進樣器,美國Harvard公司；Milliplus2150超純水處理系統(tǒng),美國Millipore公司；Sorvall高速冷凍離心機,美國Thermo Fisher公司；Masslynx 4.1數(shù)據(jù)采集軟件和LiveID統(tǒng)計分析軟件,美國Waters公司。

圖1 iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜裝置圖Fig.1 The setup of iKnife intelligent monopolar electrode mass spectrometry

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品準備 將金槍魚內(nèi)臟等副產(chǎn)物于冰溫解凍,用濾紙擦拭表面水分,置于實驗臺面待iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜檢測。

1.3.2 質(zhì)譜條件 使用iKnife智能手術(shù)刀切割金槍魚內(nèi)臟組織表面,形成含有大量磷脂離子的氣溶膠,經(jīng)Venturi泵氮氣(2 bar)驅(qū)動,采用正交方式經(jīng)聚四氟乙烯(poly tetra fluoroethylene,PTFE)管引入質(zhì)譜儀,主要裝置如圖1；以丙二醇/亮氨酸腦啡肽混合物為輔助溶劑,經(jīng)針泵注射進樣器以0.1 mL·min-1的流量引入快速蒸發(fā)離子化質(zhì)譜(rapid evaporative ionization mass spectrometry,REIMS)接口,用于進樣管路清洗,提高信號強度、鎖定質(zhì)量校正；質(zhì)譜接口內(nèi)設(shè)Kanthal A1燈絲(1.1 Ω,3 V,800℃)用作輔助碰撞電離,離子碰撞后進入質(zhì)譜儀StepWave裝置；質(zhì)譜儀掃描時間:1s；掃描范圍:m/z 100～1 200；質(zhì)譜模式:靈敏度模式；進樣補償電壓(offset potential):12 V；所有數(shù)據(jù)均以負電離模式收集。

2 結(jié)果與分析

2.1 iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜條件優(yōu)化

影響iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜信號響應(yīng)的因素包括Q-TOF質(zhì)譜儀常規(guī)參數(shù)和離子源部分參數(shù),其中,常規(guī)參數(shù)主要為碰撞解離電壓和氮氣壓強。由于相關(guān)研究報道已較多,因此本試驗中不再探討和贅述。決定金槍魚內(nèi)臟組織表面磷脂離子化效率的因素主要為電刀切割輸出功率和切割速率,以特征磷脂離子峰m/z 745.5、790.5、885.6和909.6的信噪比為指標優(yōu)化參數(shù)。

由圖2-A可知,iKnife輸出功率對磷脂離子信號影響較為明顯。當功率較低時能量偏低,金槍魚內(nèi)臟組織表面化合物離子化不充分；當功率過高時,容易產(chǎn)生較多的基質(zhì)化合物,對目標離子產(chǎn)生干擾。試驗首先以5 W的iKnife輸出功率切割金槍魚內(nèi)臟,目標磷脂離子均能較好地產(chǎn)生信號響應(yīng),且其信噪比隨著輸出功率的提高呈現(xiàn)上升趨勢；當輸出功率為15 W時,各個磷脂離子信噪比均達到最高值,分別為34.9(m/z 745.5)、60.5(m/z 790.5)、21.3(m/z 885.6)和 58.0(m/z 909.6)；當進一步提高輸出功率時,磷脂離子信噪比反而下降,且趨勢逐漸加強。因此,試驗設(shè)置iKnife輸出功率為15 W。

當切割速度較慢時,iKnife在金槍魚內(nèi)臟組織表面駐留時間較長,容易導致特定區(qū)域組織焦糊化,進而產(chǎn)生過多基質(zhì)離子；當切割速度過快時,組織表面化合物離子化不完全,信號響應(yīng)較低。由圖2-B可知,在0.5～2.5 mm·s-1范圍內(nèi)優(yōu)化切割速度并選取最佳試驗條件,當以1 mm·s-1的速度切割金槍魚組織時,各個特征磷脂離子峰信噪比均達到最高,過快或過慢均會造成信噪比下降。因此,試驗過程中iKnife切割金槍魚內(nèi)臟組織時速度保持在1 mm·s-1。

2.2 金槍魚副產(chǎn)物檢測

通過對金槍魚副產(chǎn)物直接進行電刀質(zhì)譜分析,掃描范圍m/z 100～1 200,同時以亮氨酸腦啡肽(m/z 554.261 5)為內(nèi)標鎖定質(zhì)量并校準質(zhì)量軸,得脂質(zhì)組學輪廓圖(圖3)。金槍魚內(nèi)臟組織表面化合物可離子化形成2簇較為顯著的離子峰簇。m/z 200～450區(qū)域為小分子化合物離子,主要離子峰為m/z 239.1和m/z 222.1等,其化學結(jié)構(gòu)尚不明確；m/z 391.2和 m/z 419.3疑似超長鏈脂肪酸FA 26:2和FA 28:2。由于本試驗主要研究對象為磷脂,因此未對上述化合物結(jié)構(gòu)做進一步研究鑒定。其余中低豐度離子為FA 20:5、FA 22:6等魚類常見脂肪酸離子[26]。磷脂分子主要分布在m/z 650～950區(qū)域,其離子信號豐度較強,通過對m/z 600～1 000區(qū)域放大分析(圖4-A),m/z 790.5響應(yīng)最高,隨后分別為m/z 745.5、m/z 909.6以及m/z 763.5等。

圖2 不同電刀切割功率輸出和切割速度條件對特征磷脂信噪比的影響Fig.2 Effect of different electric power output and cutting speed on the signal-to-noise ratio of representative phospholipid ions

圖3 iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜實時獲取金槍魚副產(chǎn)物脂質(zhì)組學圖譜Fig.3 The mass spectrum of tuna byproduct using iknife intelligent monopolar electrode mass spectrometry

2.3 磷脂分子鑒定與豐度分析

對質(zhì)譜圖4-A降噪、去同位素等處理,篩選峰面積大于1.00E+05的離子峰,根據(jù)其分子質(zhì)量測定值推算其可能的化學結(jié)構(gòu),并使用串聯(lián)質(zhì)譜/二級質(zhì)譜(tandem mass spectrometry,SMZ)進行驗證。以m/z 885.55為例,其離子質(zhì)量與[PI 38∶4-H]-(C47H82O13P-,885.549 9)最為接近,通過子離子掃描(product ion scan)將母離子解離得到圖4-B,可明顯觀察到由m/z 885.55斷裂的脂肪酸鏈子離子m/z 283.2(FA 18:0)和m/z 303.1(FA 20:4),碳原子數(shù)和雙鍵數(shù)與前期推測38:4吻合,故可確認 m/z 885.55為[PI 38∶4-H]-。通過這種方法可對大多數(shù)磷脂離子結(jié)構(gòu)進行確認,部分低豐度離子因為離子信號響應(yīng)不足未做MS2確認。由表1可知,金槍魚內(nèi)臟中共鑒定出磷脂離子峰41種,質(zhì)量范圍m/z 699.5～911.6,根據(jù)信號強度采用歸一化法計算相對豐度,相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為1.02～4.71。信號最強離子峰m/z 790.5經(jīng)鑒定為[PE 40:6-H]-,相對豐度達到10.03%；其次為m/z 745.5([PA 40:7-H]-),相對豐度為9.02%。

表1 金槍魚內(nèi)臟中磷脂成分與相對含量Table 1 The composition and relative contents of phospholipids in tuna byproduct

圖4 金槍魚副產(chǎn)物中主要磷脂成分質(zhì)譜圖Fig.4 The mass spectrum of phospholipids from tuna byproduct

2.4 方法驗證

選取m/z 745.5、790.5、885.6和909.6為特征離子對iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜金槍魚內(nèi)臟檢測方法進行驗證,結(jié)果見表2。首先對方法選擇性進行分析,考察磷脂質(zhì)量偏差及雜質(zhì)對質(zhì)量軸的干擾,以m/z 790.5為例其結(jié)構(gòu)鑒定為[PE 40:6-H]-(C45H77NO8P-),負離子模式下離子計算值為m/z 790.538 7,實際測定值為m/z 790.541 8,經(jīng)計算其誤差值為3.9×10-6。目標離子的誤差范圍在1.4～4.5×10-6范圍內(nèi),表明iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜質(zhì)量測定精確,選擇性好。方法精密度采用日內(nèi)和日間精密度衡量,使用iKnife智能手術(shù)刀連續(xù)平行切割金槍魚內(nèi)臟組織5次,根據(jù)相對含量計算質(zhì)譜圖中目標離子RSD,得到日內(nèi)精密度；以相同試驗條件連續(xù)平行測試7 d,計算RSD獲得日間精密度。結(jié)果表明,該方法日內(nèi)精密度為3.8%～5.1%,日間精密度為4.3%～6.3%。

表2 iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜金槍魚內(nèi)臟中磷脂檢測方法驗證Table 2 The validation of iKnife intelligent monopolar electrode mass spectrometry method for lipidomics profiling of tuna byproduct

3 討論

現(xiàn)有的常規(guī)液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法操作過程復(fù)雜繁瑣,極大地限制了其在食品科學領(lǐng)域的應(yīng)用。iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜是一種無需任何樣品前處理的實時質(zhì)譜分析方法。該方法在原位將樣品直接表面離子化,獲得質(zhì)譜脂質(zhì)組學輪廓圖,使用LiveID等軟件識別輪廓圖并對特征離子峰降維、建模后,可實現(xiàn)對未知樣品的實時鑒定與準確度評分。由于前端未聯(lián)用高效液相色譜等分離技術(shù)[27],所以目前iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜相關(guān)研究主要以定性為主。因此本研究主要關(guān)注金槍魚副產(chǎn)物的脂質(zhì)組學輪廓和相對豐度,而未對各個脂質(zhì)分子的絕對含量做具體討論。

與之前的iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜相關(guān)研究相同[16-17],本研究從金槍魚內(nèi)臟中檢出代謝物組成也是以脂質(zhì)為主,其中磷脂分子種類最多的是磷脂酰肌醇(phosphatidyli nositol,PI),共檢出13種PI分子。脂質(zhì)以外其他極性較大、穩(wěn)定性較差的代謝物的檢測,需要對組織樣品的汽化蒸發(fā)能量進行深入的優(yōu)化,降低切割能量,并進一步提高檢測方法的靈敏度。但是,切割能量的降低,會大幅降低脂質(zhì)化合物的汽化蒸發(fā)電離效率,不利于脂質(zhì)組學研究。本研究中,生物體中含量最多的磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)分子檢出較少,可能是由于iKnife智能手術(shù)刀能量較高,電切過程中通過電能傳輸導致PC丟失N(CH3)3,如m/z 699.50([PC-N(CH3)3]-)等；部分PC直接脫落膽堿基團而生成[PA-H]-,印證了結(jié)果中較多[PA-H]-的檢出,如 m/z 719.5([PA 38∶6-H]-)、m/z 745.5([PA 40∶7-H]-)等。汽化蒸發(fā)電離能量或切割能量,可直接決定質(zhì)譜圖譜中檢測到的代謝物,因此,是影響本研究結(jié)果的重要影響因素之一。對PC的深入研究,可將質(zhì)譜儀轉(zhuǎn)換成更適合PC離子化的正離子模式,并對電切能量進行相應(yīng)優(yōu)化后進行。大量磷脂代謝物的同位素離子峰容易在質(zhì)譜圖中重疊,影響其鑒別,除本研究采用的二級碎裂質(zhì)譜法外,在以后的研究中,還可以利用最新的離子淌度譜對不同遷移速率的離子進行快速分離后,再進行質(zhì)譜分析檢測,盡量避免質(zhì)譜圖中大量離子峰的重疊交叉。

由于磷脂在生物組織中主要以細胞膜形式存在[28],無法人為構(gòu)建空白樣品和梯度濃度標準樣品體系,因此本研究在驗證iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜新方法時直接以信噪比為指標檢測方法的靈敏度,驗證結(jié)果表明該目標離子在前期優(yōu)化的試驗條件下信號響應(yīng)強,信噪比為21.3～60.5,iKnife智能手術(shù)刀離子化能力強,靈敏度高。日內(nèi)和日間精密度結(jié)果表明,該方法的精密度高,結(jié)果可重復(fù)。上述結(jié)果充分證明iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜可滿足金槍魚及其他水產(chǎn)副產(chǎn)物的脂質(zhì)組學研究的需求。

4 結(jié)論

本研究建立了一種利用iKnife智能手術(shù)刀質(zhì)譜實時脂質(zhì)組學研究金槍魚內(nèi)臟的方法。通過優(yōu)化電刀輸出功率、切割速率等參數(shù),提高了特征磷脂的信噪比和信號穩(wěn)定性。由于國內(nèi)目前尚未有iKnife相關(guān)技術(shù)研究報道,該成果可為生物質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展提供參考,并為金槍魚內(nèi)臟的營養(yǎng)價值研究提供參考,為金槍魚副產(chǎn)物中脂質(zhì)檢測與綜合利用提供依據(jù)與支持。