實(shí)驗(yàn)性脂肪肝出血綜合征患雞生理參數(shù)變化

姜錦鵬， 凌 強(qiáng)， 楊亞洲

(安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

脂肪肝出血綜合征(Fatty liver hemorrhagic syndrome，F(xiàn)LHS)，是由于營養(yǎng)障礙、內(nèi)分泌失調(diào)、脂肪代謝紊亂導(dǎo)致肝臟發(fā)生脂肪變性并伴有出血為特征的一種營養(yǎng)代謝性疾病[1]。近年來，隨著我國養(yǎng)禽業(yè)的迅猛發(fā)展[2]，集約化養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大[3]，蛋雞、肉雞發(fā)生FLHS已變得相當(dāng)普遍，且呈逐年增多的趨勢。病雞主要表現(xiàn)為肥胖、開產(chǎn)期延遲、產(chǎn)蛋量急劇下降、產(chǎn)蛋高峰維持時間短，有的病雞因肝功能障礙或肝臟破裂出血而突然死亡，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[1]。

雖然近年來對雞脂肪肝出血綜合征的研究報(bào)道較多，但主要集中于雞FLHS發(fā)病期間血液生化指標(biāo)、肝臟組織學(xué)等方面的變化[4]，而開展FLHS患雞血壓、心率、呼吸頻率和心電等生理參數(shù)變化的研究甚少。由于該病多呈現(xiàn)散發(fā)性，且死前難以診斷，因此，建立其病理模型是開展該病研究的基礎(chǔ)[5-6]。陳興勇等[7]最近研究表明，產(chǎn)蛋雞血漿雌激素水平明顯高于開產(chǎn)前蛋雞，且在產(chǎn)蛋下降期仍持續(xù)增加。陳焱給產(chǎn)蛋高峰期蛋雞注射雌激素2周后，顯著增加了肝臟脂肪含量和肝臟出血指數(shù)，F(xiàn)LHS發(fā)生率達(dá)70%。上述研究說明，高的內(nèi)源性或外源性雌激素水平可能與雞FLHS的發(fā)生相關(guān)[8]。前期試驗(yàn)表明，給未成熟肉仔雞肌注雌激素，可成功建立雞FLHS模型[5-6]。因此，本試驗(yàn)根據(jù)前期建立的雞FLHS建模方法，肌肉注射雌激素復(fù)制實(shí)驗(yàn)性雞FLHS病例，采用生物信號采集與分析系統(tǒng)描記血壓、心電活動，并測定呼吸頻率、心率等生理參數(shù)，旨在為正確診斷和預(yù)防雞FLHS提供一些參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

BL-420F生物信號采集與分析系統(tǒng)，PT-100生物血壓傳感器，心電圖信號輸入線均購自四川成都泰盟科技有限公司；TA2004N電子天平(上海精密儀器廠)；三通管，動脈套管，動脈夾，銀針，手術(shù)剪，眼科剪。苯甲酸雌二醇(純度99%，上海依赫生物科技有限公司)；肝素鈉注射液(1.25萬單位/2 mL，天津生物化學(xué)制藥有限公司)；戊巴比妥鈉(純度99%，上海榮創(chuàng)生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)日糧 817肉雜雞購于安徽蚌埠華信禽業(yè)有限公司。基礎(chǔ)日糧為肉雞中期配合顆粒飼料(安徽淮北正虹飼料有限公司)，其主要原料組成：玉米、豆粕、進(jìn)口魚粉、次粉、磷酸氫鈣、食鹽、多種維生素、微量元素、氨基酸等。肉雞中期日糧：粗蛋白質(zhì)為19.0%，粗纖維為5.5%，粗灰分為7.0%，鈣為0.7%～1.2%，總磷為0.55%，食鹽為0.2%～0.8%，蛋氨酸為0.40%。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 29日齡817肉雜雞96只隨機(jī)分為對照組及試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)8只。試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組肌肉注射苯甲酸雌二醇，劑量分別為 30、300、3 000 μg/kg·bw，對照組肌肉注射相應(yīng)體積的玉米油，每3天 1次，共4周。試驗(yàn)期間，每2天測量1次呼吸頻率。處理4周后描記雞的心電圖、血壓等指標(biāo)。

1.2.3 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)期間，雞只分籠飼養(yǎng)，每個重復(fù)1籠，光照時間為16 h/d，自由采食和飲水，每天定時打掃衛(wèi)生和消毒，并按常規(guī)接種疫苗和驅(qū)蟲。

1.3 測定項(xiàng)目及分析方法

1.3.1 呼吸頻率 在雞處于安靜狀態(tài)時，統(tǒng)計(jì)1 min腹部羽毛起伏的次數(shù)，即為呼吸頻率[9]。每組各測量9只。

1.3.2 血壓 采用直接測壓法。雞翅下靜脈注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg·bw)將雞麻醉，麻醉后背位固定，鈍性分離股部肌肉，找到股動脈，遠(yuǎn)心端用絲線結(jié)扎，近心端用動脈夾夾住。用眼科剪在結(jié)扎處的向心方向作一斜行切口，將灌有肝素-生理鹽水的動脈套管插入動脈內(nèi)，用絲線固定套管。將生物血壓傳感器與BL-420F外置信號采集盒前置面板上1通道相連，再將動脈插管與生物血壓傳感器相連，并與裝有肝素-生理鹽水的注射器通過三通將生物血壓傳感器腔內(nèi)和動脈插管內(nèi)的空氣完全排出。觀察血壓波形，待其穩(wěn)定10 min后，測量股動脈的收縮壓和舒張壓。

1.3.3 心電圖 雞翅下靜脈注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg·bw)將雞麻醉，仰臥保定于絕緣的解剖臺上。將銀針分別插于右翼(相當(dāng)于肱部)皮下和左右腿(股部外側(cè))皮下，并將心電圖信號輸入線按心電導(dǎo)聯(lián)連接方式與銀針連接(即白色、紅色、黑色導(dǎo)聯(lián)線分別與右翼皮下銀針和左右腿皮下銀針連接)，再將信號輸入線與計(jì)算機(jī)ECG插口連接。電極安放15 min后，打開計(jì)算機(jī)，由“輸入信號”下拉菜單1通道中選定“心電”，調(diào)節(jié)儀器參數(shù)(G：2 mV,T：IS,F：30 Hz，掃描速度：250.0 ms/div)，即可在該通道上記錄出標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)的心電。測量指標(biāo)與方法如下:

(1)QRS綜合波時間：測量QRS波起點(diǎn)與終點(diǎn)之間的時程。

(2)P波時間：測量P波起點(diǎn)與終點(diǎn)之間的時程。

(3)PR段：測量P波終點(diǎn)到QRS波起點(diǎn)之間的時程。

(4)PR間期：測量P波起點(diǎn)到QRS波起點(diǎn)之間的時程。

(5)心率：測量相鄰兩個心動周期的R-R間期，代入右側(cè)公式計(jì)算。心率(次/min)=60/(R1-R2)。

1.3.4 臨床表現(xiàn)與剖檢特征 試驗(yàn)期間，每天觀察并記錄雞的精神狀況、食欲、行為表現(xiàn)、外貌特征(如雞冠顏色)、發(fā)病、死亡情況等。并于處理28 d(56日齡)每組隨機(jī)選擇6只雞，空腹稱重后剖檢，觀察肝臟顏色、出血情況及其它組織器官的變化。分離雞的心臟、肝臟、腹脂(腹脂肪墊和肌胃外脂肪)并稱重。心臟重量稱量后，再沿室間溝將心臟分成左右心室，稱量左心室重量。按下式計(jì)算心臟、肝臟、腹脂相對重以及左心室相對重。

心臟相對重量=心臟濕重(g)/宰前活體重(kg)；

肝臟相對重量=肝臟濕重(g)/宰前活體重(kg)；

腹脂相對重量=腹脂重(g)/宰前活體重(kg)；

左心室相對重量=左心室重(g)/全心重(g)×100%。

肝臟出血程度按照5級劃分法[6]，以肝臟出血分?jǐn)?shù)表示。屠宰后，記錄肝臟表面的出血點(diǎn)數(shù)或出血斑數(shù)。1級為沒有出血，2級為1～5個出血點(diǎn)或斑，3級為6～15個出血點(diǎn)或斑，4級為16～25個出血點(diǎn)或斑，5級為大于25個出血點(diǎn)(斑)或大出血。3級以上判為FLHS雞，2～3級之間判為亞臨床雞，2級以下判為正常雞。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。差異顯著性檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因子方差分析(One way ANOVA，LSD)，差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床表現(xiàn)與剖檢特征

試驗(yàn)Ⅲ組在處理10 d后，部分雞開始出現(xiàn)張口呼吸、嗜睡喜臥等行為變化以及肉髯稍有發(fā)白、腹部大而下垂特征。試驗(yàn)Ⅱ組約在處理20 d后出現(xiàn)上述癥狀。試驗(yàn)期間，試驗(yàn)Ⅰ組、對照組未見上述癥狀。試驗(yàn)雞只無死亡。剖檢時發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)Ⅲ組雞的皮下及腹腔脂肪過度沉積，肝臟明顯腫大、邊緣鈍而厚、質(zhì)脆易碎、黃染、切面外翻，用手觸摸有明顯油膩感，表面可見散在點(diǎn)狀或斑狀出血點(diǎn)。試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組的臨床癥狀、剖檢特征的變化趨勢與試驗(yàn)Ⅲ組相似，但程度稍輕。對照組肝臟顏色呈赤褐色、表面光滑、邊緣銳利、包膜完整、質(zhì)地較緊密、大小正常。

2.2 心臟、肝臟、腹脂相對重量及肝臟出血分?jǐn)?shù)

由表1可見，肌注雌激素28 d后，試驗(yàn)Ⅲ組肝臟相對重量明顯增加，與其余3組相比差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)；試驗(yàn)組雞的肝臟出血程度增加，肝臟出血分?jǐn)?shù)均顯著高于對照組，其中試驗(yàn)Ⅲ組與對照組相比，差異極顯著(P<0.01)；試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組腹脂相對重量均明顯高于對照組和試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.01)；各組心臟相對重量和左心室相對重量無顯著差異(P>0.05)。

表1 肝臟出血分?jǐn)?shù)和心臟、肝臟、腹脂相對重量的變化

注：同行數(shù)據(jù)，肩標(biāo)沒有字母或相同小寫字母者表示差異不顯著(P>0.05)，肩標(biāo)不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，肩標(biāo)不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.3 血壓和心率

肌肉注射不同劑量(30、300、3 000 μg/kg·bw)雌激素，使雞的收縮壓、舒張壓和心率均呈不同程度的降低(表2)，其中收縮壓分別比對照組下降了35.78%(P<0.01)、50.25%(P<0.01)、46.11%(P<0.01)，舒張壓分別比對照組下降了52.55%(P<0.05)、55.78%(P<0.01)、49.32%(P<0.05)，心率分別比對照組下降了0.06%(P>0.05)、1.02%(P>0.05)、12.46%(P<0.05)。

表2 血壓和心率的變化

2.4 心電活動

2.4.1 QRS綜合波時間和P波時間 雌激素處理4周后，試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組的QRS綜合波時間明顯變長(圖1左)，與對照組和試驗(yàn)Ⅰ組相比較，差異均顯著(P<0.05或P<0.01)；試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的P波時間也比對照組明顯延長(圖1右)。

圖1 雞QRS綜合波時間(左圖)和P波時間的變化(右圖)

2.4.2 PR段時間和PR間期 由圖2可以看出，與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的PR間期延長(圖2右)，其中試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組達(dá)顯著水平(P<0.05或P<0.01)，而PR段時間變化不大(圖2左)，差異不顯著(P>0.05)。

圖2 雞PR段時間(左圖)和PR間期的影響(右圖)

2.5 呼吸頻率變化

由表3可以看出，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組雞只的呼吸頻率與對照組相比未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表3 試驗(yàn)期間雞呼吸頻率的變化

3 結(jié)論與討論

雞FLHS是籠養(yǎng)蛋雞的一種常見病和多發(fā)病。FLHS與體內(nèi)雌激素水平升高有關(guān)，通過注射外源性雌激素可以建立雞FLHS模型。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量(3 000 μg/kg·bw)雌激素處理可使雞的肝臟出血分?jǐn)?shù)和肝臟重量增加；剖檢觀察顯示典型的FLHS病變，雞皮下及腹腔脂肪過度沉積，肝臟嚴(yán)重脂肪變性，肝臟明顯腫大、邊緣鈍而厚、質(zhì)脆易碎、黃染、切面外翻，用手觸摸有明顯油膩感，表面可見散在點(diǎn)狀或斑狀出血點(diǎn)，符合雞FLHS模型判定標(biāo)準(zhǔn)，表明造模成功。

動脈血壓的高低受外周阻力、心率、循環(huán)血量與血管系統(tǒng)容量比值等因素的影響[10]。血管口徑和血液黏度是構(gòu)成外周阻力的主要因素。崔恒敏等[11]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LHS雞全血黏度、血漿黏度顯著升高。血液黏滯度增高，可能增加外周阻力及心臟負(fù)擔(dān)，使血壓升高。但本試驗(yàn)中，雌激素誘導(dǎo)的FLHS雞的股動脈收縮壓和舒張壓不僅沒有升高，反而下降了。這可能由于雌激素促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)、降低血漿內(nèi)皮素-1(ET-1)濃度[12]，并阻滯血管平滑肌細(xì)胞的鈣離子通道[13]，致使血管擴(kuò)張，降低外周阻力以及循環(huán)血量與血管系統(tǒng)容量比值，從而降低血壓。

QRS波群持續(xù)時間，代表沖動在心室肌擴(kuò)布所需要的時間，是對心室內(nèi)興奮傳導(dǎo)的評價。PR間期代表心房開始去極到心室開始去極的時間間期，是對房室間興奮傳導(dǎo)的評價。P波反映左右兩心房的去極化過程，P波時間相當(dāng)于興奮在兩個心房傳導(dǎo)的時間[10]。研究結(jié)果表明，雌激素誘導(dǎo)的FLHS患雞的心率降低，而其QRS綜合波時間、PR間期和P波時間均延長，這提示心肌的自律性降低以及興奮在患雞兩個心房間、房室間和心室內(nèi)的傳導(dǎo)速度減慢。謝水紅等[14]通過離體蛙心灌流試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)雌二醇對離體蛙心臟具有抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，心肌收縮力和心率減慢。陳麗娜等[15]發(fā)現(xiàn)，雌二醇濃度依賴性和時間依賴性延長兔竇房結(jié)細(xì)胞動作電位時程及3期復(fù)極時間、降低竇房結(jié)細(xì)胞動作電位0期最大去極速率和延長0期去極時間，從而降低心率。這說明一定劑量的雌激素將引起雞的心率和心肌收縮力下降。另有研究表明，F(xiàn)LHS雞血漿Ca2+濃度顯著升高[16]。Ca2+除了參與心肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)，增強(qiáng)心肌收縮力外，還參與心肌細(xì)胞的電活動[10]。細(xì)胞外鈣或血鈣濃度升高時，由于Ca2+對鈉通道的屏障作用增強(qiáng)，使得Na+內(nèi)流減少，閾電位上移，膜電位的距離加大，興奮性降低。同時，高血鈣減慢Na+內(nèi)流，不僅降低心肌細(xì)胞的去極化速度，而且上移閾電位水平，均導(dǎo)致興奮的擴(kuò)布速度減慢，傳導(dǎo)性降低。另外，高血鈣導(dǎo)致快反應(yīng)自律細(xì)胞的鈉離子內(nèi)流速度減慢，而鉀離子外流速度相對加速，使自動去極化速度降低，即自律性降低。高產(chǎn)家禽，其體內(nèi)雌激素的含量也相對較高。由其體內(nèi)高濃度的雌激素誘發(fā)的FLHS也降低心肌的傳導(dǎo)性與自律性。高血鈣水平可能是雌激素誘導(dǎo)的FLHS患雞心肌傳導(dǎo)性與自律性降低的原因之一。

本試驗(yàn)中，雖然試驗(yàn)組呼吸頻率與對照組相比未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但高劑量組(試驗(yàn)Ⅲ組)在雌激素肌肉注射10 d后呼吸頻率有增加的趨勢，同時臨床觀察也發(fā)現(xiàn)部分雞只張口呼吸，這也提示FLHS雞的呼吸運(yùn)動有所加強(qiáng)。這可能由于長期高劑量雌激素使雞的血液黏度增加，血管擴(kuò)張，血流緩慢，紅細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致機(jī)體缺氧，刺激外周化學(xué)感受器，使呼吸運(yùn)動加強(qiáng)，呼吸頻率加快。

綜上所述，雌激素誘發(fā)的實(shí)驗(yàn)性FLHS患雞的收縮壓、舒張壓和心率顯著降低，QRS綜合波時間、P波時間和PR間期明顯延長，呼吸頻率也有增加的趨勢，說明實(shí)驗(yàn)性FLHS患雞的心血管和呼吸系統(tǒng)的生理功能發(fā)生了變化。