開環(huán)異落葉松樹脂酚的提取及其對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響研究

程 晨，陳 鵬，王新天，于 坤，鄭 暢，黃慶德，鄧乾春

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 油料作物研究所，油料脂質(zhì)化學(xué)與營養(yǎng)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部油料加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430062)

亞麻木酚素是一種以開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷(SDG)為單位結(jié)構(gòu)、具有抗氧化活性的生物大分子，在人體腸道中的菌群作用下經(jīng)過水解、去羥基化、去甲基化和氧化形成具有預(yù)防乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等功能的腸二醇(END)和腸內(nèi)酯(ENL)[1-5]。亞麻木酚素特殊功能特性主要來源于END和ENL[6]，其生物利用率也主要取決于SDG通過轉(zhuǎn)化形成ENL和END的比例[7-8]。研究表明，約57.2%SDG在人體腸道內(nèi)能被轉(zhuǎn)化形成ENL和END[9]，但遠(yuǎn)低于其水解產(chǎn)物開環(huán)異落葉松樹脂酚(SECO)在人體腸道內(nèi)的轉(zhuǎn)化率(72%)[7]。因此，SECO可能比SDG具有更強(qiáng)的對(duì)人體健康的干預(yù)調(diào)理作用。

乳液口服遞送體系作為一種經(jīng)典的脂質(zhì)載體，可有效提高脂溶性生物活性成分的生物利用率[10]，目前被廣泛應(yīng)用于牛奶、蛋黃醬、蛋白飲料、奶油、冰激凌等食品體系中。乳液通常為熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，在儲(chǔ)藏過程中易發(fā)生絮凝、聚集、奧氏熟化、乳析等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響相關(guān)產(chǎn)品的外觀及口感。此外，由于乳液的粒徑較小，增大了油脂與氧氣接觸的表面積，降低了乳液的氧化穩(wěn)定性。研究表明，SECO、SDG是良好的天然抗氧化劑，能有效防止油脂的自動(dòng)氧化[11]，顯著提高乳液體系中油脂的氧化穩(wěn)定性。在脂質(zhì)體體系中，弱極性SECO在乳液界面處聚集，與磷脂分子發(fā)生相互作用，有利于提升體系物理穩(wěn)定性[12]，但極性SDG在儲(chǔ)藏過程中，其糖苷基可進(jìn)入脂質(zhì)體膜相鄰磷脂分子之間的空隙，增大界面膜的間隙，破壞體系的物理穩(wěn)定性[13]。綜上，考察SDG和SECO對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響具有重要意義。然而目前市售SDG、SECO主要通過化學(xué)合成法獲得，具有產(chǎn)量低、成本高、安全性差等特點(diǎn)，限制了其在食品工業(yè)中的研究與應(yīng)用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過水解植物性來源的亞麻木酚素制備SECO，對(duì)于獲取高純度的SECO提取物、降低生產(chǎn)應(yīng)用成本和實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用具有重要參考價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)選用含50%SDG的木酚素粗提物(50%SDG)為原料進(jìn)行酸水解，以SECO含量為指標(biāo)，對(duì)SECO的HCl濃度和水解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步通過有機(jī)溶劑萃取、真空冷凍干燥工藝獲得SECO粗提物，探究水解前后亞麻木酚素粗提物對(duì)在高溫儲(chǔ)藏環(huán)境下的磷脂-亞麻籽油乳液穩(wěn)定性影響，以期為擴(kuò)大亞麻木酚素的應(yīng)用領(lǐng)域、推進(jìn)PUFAs相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

50%SDG，購于成都仕凱生物科技公司；一級(jí)亞麻籽油，購于紅井源油脂有限責(zé)任公司；大豆卵磷脂(s-75)，購于LipoidTM公司。

鹽酸、甲醇、異丙醇、異辛烷、丁醇、三氯化鐵、醋酸鈉、乙酸、無水乙醚、三氯乙酸、硫氰酸銨、氯化鋇、硫酸亞鐵，國藥化學(xué)試劑有限公司；硫代巴比妥酸(TBA)，Aladdin公司；開環(huán)異落葉松樹脂酚葡萄糖苷(SDG，98%)、開環(huán)異落葉松樹脂酚(SECO，95%)、過氧化氫異丙苯、1,1,3,3-四乙氧基丙烷(TEP)，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易公司；開環(huán)異落葉松樹脂酚單葡萄糖苷(SMG，98%)、脫水開環(huán)異落葉松樹脂酚(98%)，上海源葉生物科技有限公司；CH3COOH、CH3OH，色譜純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

分析天平，恒溫水浴搖床，電熱恒溫箱，臺(tái)式離心機(jī)，IKA數(shù)字高速剪切機(jī)，高壓微射流均質(zhì)機(jī)，Waters超高效液相分析儀，DU800紫外-可見分光光度儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞麻木酚素的酸水解

參照臧茜茜等[14]的方法進(jìn)行酸水解亞麻木酚素。取6 g 50%SDG于50 mL玻璃管中，依次加入40 mL不同濃度HCl溶液(0.2～2 mol/L)，2 500 r/min 下振蕩30 min后，將每個(gè)濃度樣品平均分為5份(每份8 mL)于玻璃管中，置于95℃水浴搖床水解210 min，在水解期間定時(shí)取樣。樣液在5 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜，濾液用超高效液相色譜(UPLC)測定SDG和SECO含量。

1.2.2 SECO的萃取

取10 mL 1.2.1中水解液(最佳酸水解條件進(jìn)行該實(shí)驗(yàn))于50 mL離心杯中離心，取上清液，加入30 mL無水乙醚，在5 000 r/min下渦旋30 min，用分液漏斗收集上層溶液，重復(fù)提取3次，將獲得的萃取液匯總并在37℃下旋蒸至10 mL，氮吹除去有機(jī)溶劑，再于-80℃下預(yù)凍30 min，置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，得到SECO粗提物。

取10 mg SECO粗提物于100 mL容量瓶，使用甲醇(色譜法)定容，0.22 μm濾膜過濾后，用UPLC測定SECO含量。

1.2.3 SDG和SECO含量的UPLC測定

UPLC條件：流動(dòng)相A為甲醇、B為0.5%乙酸水溶液，進(jìn)樣量2 μL，在洗脫流速0.1 mL/min下進(jìn)行非線性梯度洗脫(0～8 min 15%A，8～12 min 15%A～28%A，12～16 min 28%A，16～24 min 28%A～55%A，24～28 min 55%A～85%A，28～32 min 85%A，32～33 min 85%A～15%A,最后以15%A保持2 min)，紫外檢測波長280 nm。采用SDG、SECO標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，相關(guān)系數(shù)為0.999。

1.2.4 磷脂-亞麻籽油乳液的制備及儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

以20%亞麻籽油為油相，含3%大豆卵磷脂的5 mmol/L磷酸緩沖液為水相，分別加入50% SDG、SECO粗提物，使SDG/SECO在整個(gè)體系中的濃度為200 μmol/L。將油水混合物使用高速剪切機(jī)在8 000 r/min下高速剪切5 min獲得粗乳液，使用高壓微射流均質(zhì)機(jī)在82 MPa的均質(zhì)壓力下循環(huán)4次，分別制備對(duì)照組、50% SDG組和SECO組磷脂-亞麻籽油乳液。將乳液放置于65℃恒溫恒濕箱中避光保存7 d并定期取樣，對(duì)乳液粒徑、氧化產(chǎn)物等指標(biāo)進(jìn)行測定，探究在高溫儲(chǔ)藏條件下水解前后亞麻木酚素粗提物對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響

1.2.5 乳液粒徑的測定

使用馬爾文納米粒徑分析儀測定在不同儲(chǔ)藏時(shí)間下磷脂-亞麻籽油乳液的粒徑。

1.2.6 初級(jí)氧化產(chǎn)物氫過氧化物含量的測定

使用紫外分光光度計(jì)對(duì)磷脂-亞麻籽油乳液體系中氫過氧化物含量進(jìn)行測定[15]。取0.3 mL乳液與1.5 mL破乳劑(異辛烷-異丙醇，體積比3∶1)混合，渦旋振蕩10 s，重復(fù)3次，每次間隔20 s，將混合液在5 000 r/min下離心10 min，取200 μL上層液體于10 mL離心管中，加入2.8 mL甲醇-丁醇(體積比2∶1)混合液，接著加入30 μL Fe2+(將0.132 mol/L BaCl2(0.4 mol/L HCl配制)與0.144 mol/L FeSO41∶1混合，5 000 r/min下離心5 min)和3.14 mol/L硫氰酸銨的混合液(體積比1∶1)，振蕩均勻，暗反應(yīng)20 min后在510 nm波長下測定吸光度。使用過氧化氫異丙苯制備標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 次級(jí)氧化產(chǎn)物丙二醛含量的測定

使用紫外分光光度計(jì)對(duì)磷脂-亞麻籽油乳液體系中丙二醛的含量進(jìn)行測定[16]。在耐高溫螺蓋玻璃皂化管中將1 mL乳液與2 mL TBA試劑混合，振蕩均勻，沸水浴15 min，冷卻至室溫后將反應(yīng)液在5 000 r/min下離心15 min，取上清液在532 nm波長下測定吸光度。用1,1,3,3-四乙氧基丙烷配制標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以TBARS值表征丙二醛含量。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 9.1軟件繪制圖表，IBM SPSS 24.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANVOA顯著性比較分析(p<0.05時(shí)，具有顯著性差異)。所有實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)平行，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸濃度和水解時(shí)間對(duì)SDG及SECO含量的影響

準(zhǔn)確稱取6 g 50% SDG于50 mL玻璃管中，在HCl濃度分別為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L，水解時(shí)間分別為100、120、150、180、210 min的條件下進(jìn)行水解，使用UPLC對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，通過與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比分別確定SDG和SECO的出峰時(shí)間，考察HCl濃度和水解時(shí)間對(duì)SDG及SECO含量的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同HCl濃度和水解時(shí)間條件下SDG(a)和SECO(b)的含量

從圖1可以看出，當(dāng)水解時(shí)間相同時(shí)，隨著HCl濃度的增加，SDG逐漸被消耗(圖1a)，而SECO含量呈先升高后降低的趨勢(圖1b)。這是由于當(dāng)HCl濃度低時(shí)，不利于分子間的相互作用，導(dǎo)致水解速率低；隨著HCl濃度增加，分子間的相互作用加快，從而提升了水解速率，因此SECO含量增加；但當(dāng)HCl濃度過高時(shí)，SECO進(jìn)一步發(fā)生水解，致使SECO含量降低。當(dāng)HCl濃度相同時(shí)，隨著水解時(shí)間的延長，SDG逐漸被消耗產(chǎn)生SECO，但SECO含量與水解時(shí)間無明顯相關(guān)性。在水解時(shí)間為120 min時(shí)具有最大的SECO含量。綜合考慮，選取水解時(shí)間為120 min、HCl濃度為1 mol/L進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 亞麻木酚素酸水解產(chǎn)物分析

在HCl濃度1 mol/L條件下，考察50% SDG水解100～210 min內(nèi)的水解過程，對(duì)其UPLC圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。

注：1.SDG；2.SMG;3.SECO；4.脫水SECO。

通過與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比，結(jié)合參考文獻(xiàn)，確定圖2中峰1為SDG，峰2為SMG，峰3為SECO，峰4為脫水SECO[17]。可見，隨著水解時(shí)間的延長，SDG的峰面積不斷減小，SDG轉(zhuǎn)化為SMG的同時(shí)SMG向SECO轉(zhuǎn)化，且有少量的脫水SECO產(chǎn)生。因此，可推斷，在SDG的酸水解過程中，當(dāng)HCl濃度為1 mol/L時(shí)，SDG水解主要分為3個(gè)階段，且同步進(jìn)行：第一階段，SDG分子脫去一分子糖苷生成SMG；第二階段，SMG脫去一分子糖苷生成苷元化合物SECO；第三階段，SECO脫去水分子形成脫水SECO。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與張文斌[18]研究結(jié)果一致，在鹽酸濃度為1 mol/L時(shí)，SDG主要水解產(chǎn)物為SMG、SECO和脫水SECO。

2.3 粗提物中SECO的含量

采用優(yōu)化后的水解參數(shù)對(duì)50%SDG進(jìn)行水解，取水解后的溶液冷卻至室溫，使用無水乙醚萃取、真空冷凍干燥制備SECO粗提物，通過UPLC測定粗提物中SECO的含量，其圖譜如圖3所示。結(jié)果表明，粗提物中SECO含量為65%(以下以65%SECO表示)。

2.4 50%SDG和65%SECO對(duì)磷脂-亞麻籽油乳液穩(wěn)定性的影響

按照1.2.4方法使用高壓微射流法制備磷脂-亞麻籽油乳液對(duì)照組、65% SECO組和50% SDG組，測得其初始粒徑分別為243、260 nm和255 nm。將乳液在65℃下避光儲(chǔ)藏7 d，對(duì)乳液儲(chǔ)藏過程中的粒徑、初級(jí)氧化產(chǎn)物和次級(jí)氧化產(chǎn)物含量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖3 SECO粗提物的UPLC圖譜

圖4 65%SECO和50%SDG對(duì)磷脂-亞麻籽油乳液粒徑的影響

從圖4可以看出，在儲(chǔ)藏過程中，對(duì)照組乳液和50%SDG組乳液的粒徑隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長而增大，且50%SDG組乳液粒徑整體大于對(duì)照組。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能是隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，SDG向磷脂界面處移動(dòng)，其糖苷基插入界面膜內(nèi)，使磷脂分子間隙增大，加速乳滴相互碰撞，致使乳滴發(fā)生絮凝和聚集[13]。此外，65℃儲(chǔ)藏7 d，與對(duì)照組相比，65% SECO組乳液粒徑降低了77%，且在整個(gè)儲(chǔ)藏過程中，65% SECO組乳液粒徑無顯著變化(p>0.05)，表明SECO顯著提高了磷脂包埋的亞麻籽油的物理穩(wěn)定性。產(chǎn)生該結(jié)果的原因可能為弱極性分子SECO主要存在于乳液界面位置，與磷脂分子發(fā)生氫鍵結(jié)合[12]，增加了乳液界面厚度，提高乳液穩(wěn)定性。

圖5 65%SECO和50%SDG對(duì)磷脂-亞麻籽油乳液氫過氧化物和TBARS值的影響

從圖5可以看出，對(duì)照組乳液初始?xì)溥^氧化物含量最高，為(0.181±0.014)mmol/kg，高于含65%SECO和50%SDG的乳液組。說明在乳液制備過程中，65%SECO和50%SDG均具有抑制乳化過程中亞麻籽油氧化的作用。乳液體系中氫過氧化物含量隨儲(chǔ)藏時(shí)間的延長而升高，儲(chǔ)藏7 d的對(duì)照組乳液中氫過氧化物含量高達(dá)(29.647±0.168)mmol/kg，而65% SECO和50% SDG分別將乳液體系中氫過氧化物含量降低11%和27%。由此可得，在乳液體系中50%SDG具有最佳的抑制亞麻籽油發(fā)生初級(jí)氧化能力。原因可能為SDG具有較好的熱穩(wěn)定性[19]，因此在65℃高溫下，SDG能穩(wěn)定存在并發(fā)揮抗氧化效應(yīng)。此外，在65% SECO中仍殘留少量的Cl-(約0.08%)，由于鹽離子可在液滴表面堆積，改變液滴的表面特性，增加了水相中金屬離子等陽離子促氧化成分與油脂的接觸，從而加速了油脂氧化[20-21]。

在乳液儲(chǔ)藏前期(0～3 d)，50% SDG和65% SECO均具有抑制亞麻籽油氧化產(chǎn)生氫過氧化物的作用。儲(chǔ)藏1 d，與對(duì)照組乳液相比，分別將乳液氫過氧化物含量降低55%和60%。原因可能是由于亞麻木酚素類多酚化合物在氧化初期能延緩乳液中油脂氧化，降低氫過氧化物等初級(jí)氧化產(chǎn)物的含量，但對(duì)氫過氧化物進(jìn)一步裂解產(chǎn)生醛、醇、酮等次級(jí)氧化產(chǎn)物含量的過程無直接影響[16]，因此50% SDG組和65% SECO 組乳液的TBARS值的變化無顯著性差異(儲(chǔ)藏1 d，與對(duì)照組相比，50% SDG組和65% SECO組乳液TBARS值分別降低了42%和40%)。但儲(chǔ)藏7 d，65% SECO組乳液中TBARS值比對(duì)照組提高了28%，加速了次級(jí)氧化的進(jìn)程，原因?yàn)?5% SECO中除SECO以外的鹽離子、亞麻蛋白等其他物質(zhì)在高溫下長期儲(chǔ)藏可能會(huì)產(chǎn)生促進(jìn)氫過氧化物裂解的物質(zhì)，加速了次級(jí)氧化產(chǎn)物的積累，但目前具體機(jī)理尚不明確，仍需進(jìn)一步探究。

3 結(jié) 論

(1)本實(shí)驗(yàn)對(duì)水解亞麻木酚素(含50%SDG)提取SECO的條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳水解條件為HCl濃度1 mol/L、水解時(shí)間120 min，此時(shí)SECO含量最高。進(jìn)一步通過無水乙醚萃取，真空冷凍干燥制備了SECO含量為65%的SECO粗提物。通過對(duì)水解產(chǎn)物UPLC圖譜分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽酸濃度為1 mol/L時(shí)，SDG首先脫去一分子糖苷生成SMG，SMG進(jìn)一步水解失去一分子糖苷生成SECO，SECO在酸的作用下失去一分子水，形成脫水SECO，且以上水解過程同時(shí)進(jìn)行。

(2)磷脂-亞麻籽油乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，50%SDG和水解產(chǎn)物65%SECO均具有抑制乳化過程中亞麻籽油氧化的作用。65℃儲(chǔ)藏7 d，與對(duì)照組相比，65%SECO組乳液粒徑降低了77%，因此65% SECO抑制了乳液在高溫儲(chǔ)藏過程中的聚集、絮凝現(xiàn)象的發(fā)生，顯著提高了乳液的物理穩(wěn)定性；儲(chǔ)藏1 d，50%SDG和65%SECO分別可將乳液體系中氫過氧化物含量降低55%和60%，TBARS值降低42%和40%。但儲(chǔ)藏7 d，65%SECO組TBARS值比對(duì)照組提高了28%，加速了次級(jí)氧化的進(jìn)程，其具體原理還需進(jìn)一步探究。