慢性皮膚潰瘍動物模型的研究進(jìn)展?

徐 凝，吳閩楓，段彥娟

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院皮膚科，上海 200437；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院皮膚科，上海 200137)

慢性皮膚潰瘍是中醫(yī)外科學(xué)的常見病、多發(fā)病，治療較為棘手，為臨床亟需攻克的難題。動物模型是進(jìn)行病因病機(jī)和治療方法研究的重要工具，因此建立操作便捷、可控性強(qiáng)、符合臨床病理特征且創(chuàng)面愈合速度較慢的動物模型有助于開展醫(yī)學(xué)實驗研究。故對目前主要的慢性皮膚潰瘍模型進(jìn)行分類歸納及綜述，以期為研究者選取慢性皮膚潰瘍動物模型提供參考。

1 全層皮膚切除模型

由于自發(fā)性潰瘍在實驗動物體表較難形成，且不易定量及標(biāo)準(zhǔn)化，故人為造成皮膚損傷是較為理想的選擇。全層皮膚切除是實驗研究中常用的造模方法，通常選取SD大鼠麻醉后在其背部脫毛區(qū)皮膚制備一處區(qū)域并標(biāo)記，按印記范圍剪去全層皮膚及皮下結(jié)締組織，避開較大血管切開皮膚深至淺筋膜，造成缺損創(chuàng)面，之后每天1次用50%冰醋酸溶液涂抹創(chuàng)面，持續(xù)1周即可形成缺損性慢性皮膚潰瘍模型[1-2]。此外，也有學(xué)者在研究中使用Wistar大鼠或家兔，麻醉后在動物背部制備1個或多個皮膚缺損，深達(dá)皮下組織，模擬臨床無法自愈的皮膚潰瘍模型[3-4]。采用全層皮膚切除法雖能形成皮膚潰瘍動物模型，但由于實驗動物的自愈能力較強(qiáng)，從潰瘍形成至創(chuàng)面愈合的自然過程約14 d，因此存在創(chuàng)面愈合延遲現(xiàn)象不明顯的弊端，與人體慢性皮膚潰瘍差距仍然較大。

2 復(fù)合損傷潰瘍模型

復(fù)合損傷潰瘍模型是在全層皮膚切除模型的基礎(chǔ)上疊加處理條件，如細(xì)菌感染、激素干預(yù)、埋置異物等，能更好地體現(xiàn)慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面發(fā)病機(jī)制的多因素特征。筆者現(xiàn)將以下幾種動物模型為例進(jìn)行闡述。

2.1 皮膚缺損-細(xì)菌感染模型

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，影響創(chuàng)面愈合的局部因素主要是感染和血液循環(huán)，感染對組織的再生妨礙最大，細(xì)菌及毒素能引起組織壞死。局部血液循環(huán)障礙造成局部缺血缺氧和代謝障礙，導(dǎo)致創(chuàng)面經(jīng)久不愈。而在實驗動物傷口內(nèi)采用局部接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等造成感染傷口模型可以模擬傷口感染，用于研究生物膜的形成[5]。馬忠麗等[6]采用體質(zhì)量200～250 g的豚鼠背部去毛后切開兩條長1 cm的傷口深達(dá)皮下，每個傷口內(nèi)注入10億個金黃色葡萄球菌，2 d后傷口周圍出現(xiàn)紅、腫、觸痛，傷口表面有膿性分泌物則表明實驗性瘡瘍豚鼠造模成功。韓曉明等[7]用SD種大白鼠于背部劃一十字切口(1 cm×1cm)深達(dá)皮下，并于傷口注射金黃色葡萄球菌懸液1 ml(10億/ml)，棉簽蘸取少許化膿性鏈球菌涂布創(chuàng)面，2 d后實驗動物見食量減少,俯臥少動,傷口有膿性分泌物,傷口周圍出現(xiàn)紅、腫、熱、痛現(xiàn)象則提示造模成功。

皮膚缺損-細(xì)菌感染模型能夠模擬感染和局部血液循環(huán)障礙為主的一類皮膚潰瘍的基本病理狀態(tài)，但因其研究側(cè)重點局限于影響創(chuàng)面愈合的局部因素，故不能全面反映慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面多因素發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性及慢性炎癥反應(yīng)的特點。

2.2 皮膚缺損-激素干預(yù)模型

現(xiàn)代研究證明，過量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可抑制蛋白合成，誘發(fā)或加重感染使肌肉萎縮，傷口愈合遲緩[8]?？梢娞瞧べ|(zhì)激素的抗炎抗增殖作用能夠造成傷口愈合障礙，這使其成為制作傷口愈合障礙模型的輔助藥物[9]。有研究者選取雄性SD大鼠以氯胺酮腹腔注射麻醉，腰椎正中偏上去毛，標(biāo)記直徑為20 mm的圓形造模區(qū)域，沿標(biāo)記線剪去皮膚和皮下組織，剪至筋膜層徹底止血，造模后創(chuàng)面局部多處肌注氫化可的松，造成難愈性創(chuàng)面模型[8、10-12]，模型組創(chuàng)面愈合時間較正常對照組明顯延長[11](P<0.01)，實驗結(jié)果提示創(chuàng)面愈合緩慢可能與TNF-α和IL-6過度高表達(dá)有關(guān)[12]。

糖皮質(zhì)激素作為疊加處理條件，能夠有效延遲創(chuàng)面愈合時間，造成難愈性創(chuàng)面模型，且操作簡單、成模率高，無疑為該病慢性炎癥反應(yīng)的病理研究創(chuàng)造了更為有利的條件。

2.3 皮膚缺損-埋置異物模型

實驗動物造成皮膚缺損后加異物埋置，在影響創(chuàng)面血液循環(huán)的同時，能夠通過持續(xù)的機(jī)械刺激在創(chuàng)面局部形成炎癥狀態(tài)進(jìn)而影響創(chuàng)面愈合[13]。蔣鳳榮等[14]在SD大鼠背部埋入一個內(nèi)徑1 cm硅膠管，深達(dá)肌筋膜深層形成潰瘍。也有研究者[15-18]選用健康SD大鼠和家兔，參照沈道修改良塑料肉芽腫定量法，將塑料環(huán)埋入剝離至筋膜的背部切口，將切口邊緣與塑料環(huán)縫合，實驗動物肌肉注射青霉素鉀鹽以防感染，制成慢性皮膚潰瘍模型。

皮膚缺損-埋置異物模型能夠利用外來的持續(xù)性機(jī)械刺激，在創(chuàng)面局部形成炎癥狀態(tài)而影響局部血液循環(huán)，從而達(dá)到創(chuàng)面難愈的目的。但模型制備時需確保異物埋置的穩(wěn)定性，對固定縫合操作要求較高，且在創(chuàng)面局部造成慢性炎癥狀態(tài)的同時需謹(jǐn)慎防范創(chuàng)面感染，造模難度相對較大。

2.4 皮膚缺損-埋置異物-細(xì)菌感染模型

人為埋置異物使得皮膚缺損形成的潰瘍因局部微循環(huán)障礙和持續(xù)的機(jī)械性刺激而經(jīng)久不愈。采用金黃葡萄球菌進(jìn)行感染模型建立，使得觀察創(chuàng)面愈合延遲現(xiàn)象的同時，也能夠?qū)崿F(xiàn)劑量調(diào)整模擬理想的慢性炎癥病理狀態(tài)。王樂平等[19-20]多次選用SD大鼠剪除背部全層皮膚后將消毒塑膠環(huán)埋入切口邊緣，并與皮膚縫合防止脫落，注入金黃色葡萄球菌液0.2 ml導(dǎo)致細(xì)菌感染，成功建立細(xì)菌感染模型。

該造模方法能夠達(dá)到創(chuàng)面周圍皮膚紅、腫、皮溫升高，創(chuàng)面有膿性分泌物，或膿性結(jié)痂、痂下積膿的潰瘍模型標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)久難愈。并能針對性地體現(xiàn)慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面發(fā)病機(jī)制的多因素特征，但模型制備時需確保異物埋置的穩(wěn)定性，對固定縫合操作要求較高。

2.5 皮膚缺損-細(xì)菌感染-激素干預(yù)模型

多位學(xué)者[21-23]將SD大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉后，剪去背部造模區(qū)域全層皮膚深達(dá)筋膜，并在筋膜下傷口處噴灑金黃色葡萄球菌，隨后肌注氫化可的松連續(xù)3 d，成功制備慢性難愈合創(chuàng)面模型。董建勛[24]等調(diào)整干預(yù)順序，將SD大鼠麻醉后肌肉注射氫化可的松，在大鼠背部造成深達(dá)皮下的傷口后，隨即在傷口周緣注入1 ml金黃色葡萄球菌液。其中采用皮膚缺損疊加細(xì)菌感染、激素干預(yù)的“復(fù)合因素”造模法，使多數(shù)大鼠表現(xiàn)出喜靜、體寒、創(chuàng)面分泌物清稀、體質(zhì)虛弱、死亡率高等特征，符合中醫(yī)學(xué) “陰證”證候特點。該動物模型操作簡易、可控性強(qiáng)，能較好地模擬中醫(yī)學(xué)的證型、證候特點，造模后大鼠的癥狀表現(xiàn)及愈合速度基本符合中醫(yī)學(xué)“陰證”的慢性皮膚潰瘍特征[13]。

2.6 糖尿病潰瘍模型

臨床上糖尿病性皮膚潰瘍是由于皮膚及血管長期處于高血糖環(huán)境，導(dǎo)致創(chuàng)面愈合遲緩。高血糖引起的炎癥介質(zhì)釋放和氧化應(yīng)激能夠?qū)е履┥已懿∽?、神?jīng)損害、微循環(huán)障礙、局部感染等病理改變，成為潰瘍和/或組織深度破壞的基礎(chǔ)，且傷口的修復(fù)愈合能力差，導(dǎo)致糖尿病足潰瘍數(shù)量迅速上升，截肢率居高不下[25]。因此糖尿病潰瘍模型在創(chuàng)面愈合過程與特征研究中具有重要意義，也可用于各種局部用藥對慢性難愈合創(chuàng)面的促修復(fù)作用評價[26]。此類模型有2種復(fù)制方法，一是選用患有遺傳性糖尿病的大小鼠(db/db)人為造成皮膚缺損；二是先建立人工糖尿病動物模型，再造成皮膚缺損創(chuàng)面。張曉義等[27]采用健康大鼠實驗前禁食12 h，定量飲水，實驗當(dāng)日按65 mg/kg劑量一次性腹腔注射經(jīng)稀釋的鏈脲佐菌素。當(dāng)動物隨機(jī)血糖升至16.7mmoL/L以上，并出現(xiàn)多尿、多飲、體質(zhì)量下降，持續(xù)1周以上則于第2周使用鹽酸戊巴比妥鈉(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，將大鼠腰背兩側(cè)皮膚脫毛消毒，作長1 cm、深達(dá)淺筋膜的縱形切口，每日50 %冰醋酸涂抹創(chuàng)面1次，持續(xù)1周制備成缺損性皮膚潰瘍大鼠模型。李媛等[28]根據(jù)大鼠體質(zhì)量腹腔注射1%鏈脲佐菌素55 mg/kg，72 h后測量隨機(jī)非空腹血糖>16.7 mmol/L，即為糖尿病模型成模，未成模者每只補(bǔ)打20 mg/kg，成模2周后大鼠股部肌肉注射氫化可的松20 mg/kg，連續(xù)3 d后在麻醉后的大鼠背部標(biāo)記4 cm×4cm的造模區(qū)域，剪去深達(dá)筋膜的全層皮膚，埋入直徑為2.5 cm的原型塑料環(huán)于大鼠潰瘍皮下，用手術(shù)線將其縫合固定造成所需模型。糖尿病鼠皮膚傷口模型的種類有急性與慢性之分，研究者大多采用急性傷口模擬臨床慢性皮膚潰瘍，即用手術(shù)刀、皮膚活檢打孔器在糖尿病鼠皮膚制備切開傷口[29]。

糖尿病潰瘍模型可以認(rèn)為是復(fù)合損傷潰瘍模型下的一個特殊情況，是糖尿病動物和其他復(fù)合損傷模型的疊加效應(yīng)產(chǎn)物分支。該模型造模操作相對簡單、重復(fù)性尚佳，且皮膚及血管長期處于高血糖環(huán)境的創(chuàng)面愈合過程與特征，在一定程度上實現(xiàn)了與人類糖尿病潰瘍的擬合，但其傷口愈合的復(fù)雜程度和臨床實際相比仍存在較大差距。值得注意的是，嚴(yán)重高血糖甚至傷口應(yīng)激情況下可能導(dǎo)致實驗動物死亡，傷口愈合相關(guān)實驗僅可在實驗動物高血糖穩(wěn)定狀態(tài)下進(jìn)行，因此糖尿病鼠造模成功后應(yīng)密切觀測、控制動物血糖。

3 結(jié)語

慢性皮膚潰瘍模型為治療藥物開發(fā)以及皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合研究提供了一個可靠的工具，理想的動物模型應(yīng)當(dāng)能夠復(fù)制、還原人類慢性皮膚潰瘍的病理及愈合的整個過程。但由于動物和人類在皮膚組織的結(jié)構(gòu)及免疫功能方面都存在巨大差異，降低了其模擬人類慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面的可靠性。因此在眾多類型的慢性皮膚潰瘍動物模型中，結(jié)合自身的研究目的，選取合適的模型顯得尤為關(guān)鍵。全層皮膚切除模型與人類慢性皮膚潰瘍存在差距，因此臨床研究應(yīng)用時應(yīng)適當(dāng)改進(jìn)，疊加處理條件，充分體現(xiàn)慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面多因素發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性及慢性炎癥反應(yīng)的特點。在復(fù)合損傷潰瘍模型中，皮膚缺損-激素干預(yù)模型、皮膚缺損-埋置異物模型、皮膚缺損-埋置異物-細(xì)菌感染模型、皮膚缺損-細(xì)菌感染-激素干預(yù)模型，在實現(xiàn)創(chuàng)面愈合延遲的同時，通過不同處理因素疊加，尋求與人類慢性皮膚潰瘍的真實擬合，但造模操作要求較高。隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的深入，單純類型的慢性皮膚潰瘍模型已經(jīng)很難滿足需要，而皮膚缺損-細(xì)菌感染-激素干預(yù)模型在模擬皮損的基礎(chǔ)上，更好地模擬了臨床患者的整體狀態(tài)，這無疑更利于中醫(yī)藥辨證論治慢性皮膚潰瘍的研究。使得慢性皮膚潰瘍的動物實驗研究不拘泥于西醫(yī)以“病”來建立模型，真正實現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)理論體系指導(dǎo)治療中的藥證統(tǒng)一。但由于慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面多因素發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性以及創(chuàng)面本身存在感染的病理狀態(tài)與慢性炎癥反應(yīng)等特點，本文列出的模型種類遠(yuǎn)不能滿足需要，尚需探索建立更為豐富、貼近人體病理狀態(tài)的實驗動物模型，從而為慢性皮膚潰瘍基礎(chǔ)研究提供更多的選擇。