羅哌卡因超前鎮(zhèn)痛對Wistar大鼠結(jié)直腸癌術(shù)后Th17的影響

白炳生 劉永前（通訊作者） 陳志剛

（1廈門醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院麻醉科 福建 廈門 361021）

（2廈門醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 福建 廈門 361021）

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，在美國等國家發(fā)病率和相關(guān)死亡率位居所有腫瘤的第三位[1]。手術(shù)是結(jié)直腸癌的主要治療方法，能顯著改善患者預(yù)后，延長生存期，但手術(shù)也不可避免的影響了患者內(nèi)分泌、代謝、炎癥和免疫應(yīng)激。圍術(shù)期免疫系統(tǒng)的改變，會直接影響患者術(shù)后的腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)[2]。在機體的抗腫瘤免疫效應(yīng)中，細胞免疫起重要作用。T淋巴細胞是細胞免疫的重要組成成分，其功能和數(shù)量的異?？梢灾苯佑绊懩[瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。本研究擬評價羅哌卡因超前鎮(zhèn)痛對Wistar大鼠結(jié)直腸癌術(shù)后th17的影響及其作用機制，為臨床應(yīng)用提供參考。

1.資料與方法

1.1 一般資料

健康雄性Wistar大鼠58只，3月齡，體重220～240(230±5)g，由廈門大學實驗動物中心提供，按參考文獻[3]介紹的方法制備結(jié)直腸癌動物模型，以二甲基肼在頸部皮下注射，8周后經(jīng)肛門直腸黏膜下注射CC531大腸癌細胞。

1.2 實驗分組與處理

模型成功后的40只大鼠進入實驗。采用隨機數(shù)值表法，將其分為四組（n=10）：結(jié)直腸癌單純手術(shù)對照組、實驗組（低、中、高劑量羅哌卡因?qū)嶒灲M）。

手術(shù)前改良硬膜外導管固定法構(gòu)建硬膜外阻滯大鼠動物模型：將無菌輸液貼剪成寬約2mm的長條型，分別于距離導管置入端尖端2cm、6cm、15cm處環(huán)形纏繞厚度約為1mm的輸液貼，分別命名為關(guān)卡1、關(guān)卡2、關(guān)卡3。管內(nèi)預(yù)充50U/mL肝素生理鹽水備用。

1.2.1 硬膜外置管 術(shù)前大鼠禁食不禁水12h，二氧化碳麻醉下氣管插管。定位第1腰椎(L1)棘突并標記。頸部和背部剔毛，常規(guī)消毒鋪巾。以L1棘突為中心行縱行切開背部皮膚，鈍性分離棘突及椎板附著肌肉組織，暴露L1～L2棘突根部，錐形針剝除T12～L1間韌帶組織，向頭側(cè)置入硬膜外導管至2cm處，行液體負壓實驗以避免導管置入硬膜下或蛛網(wǎng)膜下腔。

1.2.2 硬膜外固定導管 實驗組大鼠縫合肌肉，縫線環(huán)繞固定法將關(guān)卡1和2固定于肌層，硬膜外穿刺針頸部做皮下隧道至切口處，引出硬膜外導管，縫合穿刺口將卡3固定在皮下，無菌膠帶封閉導管備用。

1.3 標本的采集

模型成功大鼠分四組：結(jié)直腸癌手術(shù)為對照組，Wistar大鼠結(jié)直腸癌手術(shù)，圍術(shù)期硬膜外注射生理鹽水空白對照；實驗組（按治療濃度劑量分三組），硬膜外羅哌卡因超前鎮(zhèn)痛，分別以0.15%、0.20%、0.25%低中高三種濃度持續(xù)泵注羅哌卡因。術(shù)后不同時點（24h、72h）二氧化碳吸入麻醉下，頸靜脈穿刺采血檢測th17。

1.3.1 頸內(nèi)靜脈采血。麻醉后大鼠仰臥，將兩上肢外展固定，大鼠右側(cè)頸部剃毛，尋找靜脈，注射器從頸根部鎖骨中線部位傾斜60度刺向胸腔方向，抽取所需2毫升血液。

1.3.2 檢測相關(guān)細胞因子的變化。

1.4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

治療前后IL-6、IL17A的變化，見表。

表 四組外周血Th17不同時點變化（±s）

表 四組外周血Th17不同時點變化（±s）

T0術(shù)前30min T1術(shù)后24h T2術(shù)后72h注：*與對照組比較，P＜0.05；與低劑量實驗組比較，P＜0.05。

組別 n IL-6（ng／L）IL-17A（ng／L）T0 T1 T2 T0 T1 T2實驗組（低劑量組） 10 52，8±3.7 30.2±4.1 31.5±3.4 155.7±9.2 48.8±11.5 50.2±10.1實驗組（中劑量組） 10 51.4±4.3 24.8±3.5* 25.7±2.3* 153.9±12.2 32.7±14.5* 30.4±11.3*實驗組（高劑量組） 10 50.8±4.1 23.5±4.4* 24.8±4.3* 154.8±11.5 30.5±13.2* 29.7±12.5*對照組（單純手術(shù)組） 10 50.5±4.2 35.8±2.5 38.4±4.8 152.8±10.5 80.5±12.3 85.1±11.4

3.討論

本實驗按參照文獻介紹的方法制備大鼠結(jié)直腸癌模型，以改良硬膜外置管法研究羅哌卡因超前鎮(zhèn)痛對Wistar大鼠結(jié)直腸癌術(shù)后免疫指標th17變化的影響。結(jié)果表明，與對照組及低劑量治療組比較，術(shù)后不同時點，中、高劑量羅哌卡因組IL-6、IL17A明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義。本研究通過羅哌卡因超前鎮(zhèn)痛對Wistar大鼠結(jié)直腸癌術(shù)后IL-6、IL17A影響的進行探討，結(jié)果揭示酰胺類局麻藥羅哌卡因?qū)Y(jié)直腸癌免疫指標的調(diào)節(jié)作用，為探索圍術(shù)期更合理的麻醉方案和鎮(zhèn)痛模式提供參考。

在機體的抗腫瘤免疫效應(yīng)中，細胞免疫起重要作用。T淋巴細胞是細胞免疫的重要組成成分，其功能和數(shù)量的異?？梢灾苯佑绊懩[瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory tcells，Treg)和輔助T細胞Th17是較為新發(fā)現(xiàn)的Th細胞亞群，它們在維持機體免疫平衡方面發(fā)揮重要作用，與腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)直接相關(guān)。輔助性T細胞17（T helPer cell 17，Th17）是CD4+T細胞家族成員之一，主要分泌IL-17A[5]。而在結(jié)直腸癌患者內(nèi)，目前研究表明Th17細胞及其細胞因子起到促進腸道內(nèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展的作用。結(jié)直腸癌的腫瘤微環(huán)境中存在多種細胞因子如IL-6、IL-17等，這些細胞因子共同誘導Th17細胞分化。消除或降低IL-17的表達，可以防治結(jié)直腸癌。

本研究結(jié)果表明：術(shù)后T1、T2時點，中劑量羅哌卡因?qū)嶒炛委熃MIL-6與對照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。T1、T2高劑量羅哌卡因?qū)嶒灲MIL-6分別與對照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明羅哌卡因超前鎮(zhèn)痛通過影響IL-6對結(jié)直腸癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移有防治作用。本研究低、中、高劑量組羅哌卡因按大鼠體表面積計算分別為0.828mg/kg.m2、1.104mg/kg.m2、1.380mg/kg.m2。低劑量羅哌卡因組與對照組比較，數(shù)值降低，但無統(tǒng)計學意義。中、高劑量組羅哌卡因組數(shù)值降低且有統(tǒng)計學意義，但臨床實踐中，滿足醫(yī)學需要的前提下，采用最低有效劑量原則。手術(shù)對照組同樣按大鼠體表面積計算后，用等容量生理鹽水泵注。

IL-17可能是一個開發(fā)腸癌新藥的靶點，研究表明Th17細胞在結(jié)直腸內(nèi)異常分化、激活及細胞因子的釋放促進了結(jié)直腸癌的形成和惡化。Th17細胞分泌IL-17促進G-CSF（granulocytecolony-stimulating factor，粒細胞集落刺激因子）的表達導致炎癥細胞遷移到腫瘤內(nèi)，這些炎癥細胞的侵入營造了特殊的腫瘤微環(huán)境，從而進一步促進了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。IL-17A是Th17細胞分泌的功能性細胞因子之一，最近的研究結(jié)果表明結(jié)直腸癌的預(yù)后與Th17細胞密切相關(guān)。因此探究IL-17A與大腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，對提高患者生活質(zhì)量、改善預(yù)后等均有積極的意義。本研究結(jié)果表明：T1、T2時點中劑量羅哌卡因?qū)嶒灲MIL17A分別與對照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。T1、T2時點高劑量羅哌卡因組IL17A分別與對照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明羅哌卡因超前鎮(zhèn)痛可能通過影響IL17A，對結(jié)直腸癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移有防治作用。

臨床手術(shù)中，局部麻醉藥的應(yīng)用非常廣泛，常用的有短效的利多卡因，中長效的布比卡因和羅哌卡因。此前尚未有羅哌卡因硬膜外超前鎮(zhèn)痛與Th17/的相關(guān)深入報道。以人為研究對象的文獻，均未合理排除術(shù)前放化療的影響。本研究在完全剔除放療、化療因素影響下，通過羅哌卡因超前鎮(zhèn)痛對Wistar大鼠結(jié)直腸癌術(shù)后IL-6、IL17A的影響進行實驗研究，結(jié)果揭示酰胺類局麻藥羅哌卡因?qū)Y(jié)直腸癌免疫指標有負向調(diào)節(jié)作用，為探索圍術(shù)期更合理的麻醉方案和鎮(zhèn)痛模式提供借鑒。

綜上所述，羅哌卡因硬膜外超前鎮(zhèn)痛作為一種操作相對簡單、安全有效、費用低廉的預(yù)防結(jié)直腸癌術(shù)后復發(fā)、轉(zhuǎn)移的方法，值得在臨床工作中應(yīng)用。