18 份櫻屬材料親緣關(guān)系的ISSR分析

周成城，楊德明，李士坤，萬佳藝，榮俊冬，鄭郁善,

(1.福建農(nóng)林大學園林學院, 福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學林學院, 福建 福州 350002；3.漳平市林業(yè)局， 福建 漳平 364400)

櫻花(Cerasusspp.)屬于薔薇科(Roasaceae)李亞科(Prunoideae)櫻屬(Cerasus)落葉喬木或小喬木，花盛開于冬末和初春，是世界上著名早春觀花樹種之一[1]。目前櫻花有200多種，主要來自日本和中國[2]，其花色豐富，樹形優(yōu)美，是優(yōu)良的園林觀賞樹種。隨著櫻花種植的發(fā)展，我國本土的櫻花資源不斷得到重視，其中福建山櫻花[Cerasuscampanulata(Maxim.) Yu et Li]是國產(chǎn)櫻花的代表之一[3]，分布于我國的福建、江西、廣西、廣東、臺灣等省，國內(nèi)有眾多種源地[4]。福建山櫻花近年來在很多園林景觀建設中得以應用[5-8]，可為我國櫻花園林應用提供更多優(yōu)質(zhì)的資源。但現(xiàn)階段櫻花研究開展了較多雜交育種工作，市場上已有新種質(zhì)或新品種出現(xiàn)，從形態(tài)學的角度難以進行準確分辨，為更好地保存、開發(fā)和利用國內(nèi)櫻花種質(zhì)資源，從分子層面進行遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒別很有必要。

簡單重復序列間擴增(inter-simple sequence repeat， ISSR)分子標記技術(shù)由ZIETKIEWICZetal[9]在1994年基于簡單重復序列擴增(simple sequence repeat， SSR)分子標記技術(shù)所建立的，其基本原理是在SSR的3或5端嵌入1組1～4個嘌呤或嘧啶堿基，并以此為引物對DNA序列具有反向排列SSR的兩側(cè)進行擴增，通過電泳、染色和分析顯像觀察譜帶的有無以及相對位置來判斷植物物種和品種間的遺傳多態(tài)性[10-12]。該分子標記技術(shù)結(jié)合了SSR和隨機擴增多態(tài)性DNA標記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)兩個技術(shù)的優(yōu)點，具有操作便捷、穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富等特點，在種質(zhì)資源分類和鑒別方面有較高的效率[13]。

在櫻花的培育中，人工培育后的品種鑒別困難，表型差異不明顯，需從基因?qū)用鎸ζ滂b別。近年來，ISSR分子標記法逐漸被使用在品種鑒定的研究中[14-15]，如蔣冬月等[16]針對不同省份的櫻亞屬園藝品種進行了ISSR品種鑒定；林立等[17]對39個國內(nèi)常見櫻花品種進行了分類研究，均取得了較好的效果。本研究收集了福建省漳平市內(nèi)18個觀賞櫻花樹種材料，利用ISSR分子標記法分析試驗材料的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，構(gòu)建櫻花指紋圖譜，以期為種質(zhì)資源的品種鑒定、分類、利用和雜交育種親本的選配等方面提供理論依據(jù)，加快國內(nèi)櫻花的良種選育和商品化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

18份櫻屬材料包括福建山櫻花、11份日本櫻花(Cerasusyedoensis)和6份選優(yōu)材料(表1)。其中選優(yōu)材料為福建省漳平市各苗木基地人工培育，親本為福建山櫻花和日本櫻花雜交，2019年6—7月采集于福建省漳平市內(nèi)櫻花觀賞品種栽培試驗區(qū)。采集生長健壯、無病蟲害的植物幼嫩葉片，用自封袋裝置于冰盒中，放置在實驗室-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 18份櫻屬材料信息Table 1 Information of 18 Cerasus materials

1.2 試驗方法

[HT5F]1.2.1 DNA提取與檢測 采用Bioflux DNA提取試劑盒(杭州博日公司提供)提取18份櫻屬材料的總DNA，用NANODROP 2000 C紫外分光光度計分析質(zhì)量和濃度，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后用透射紫外燈照相觀察并分析總DNA純度，于-20 ℃保存。

[HT5F]1.2.2 ISSR引物篩選與PCR擴增 根據(jù)加拿大哥倫比亞大學設計并公布的ISSR引物序列[18]，試驗所用引物由上海尚亞生物有限公司合成。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction， PCR)體系包括100 ng模板DNA、2 μL(10 μmol·L-1)引物、15 μL PCR反應混合物(Taq酶、dNTPs、MgCl2以及反應緩沖液預先配制成2倍濃度的混合物)，加入去離子水達到25 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性1 min，50～55 ℃退火30 s(每次下降1 ℃)，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。采用1.5%瓊脂糖凝膠加入10 μL PCR擴增產(chǎn)物，篩選出能擴增出清晰條帶的引物?；谛ち盏萚19]和馮晨靜等[20]對薔薇科植物ISSR-PCR擴增體系的優(yōu)化條件，對各供試材料總DNA進行擴增，產(chǎn)物和100 bp DNA ladder、1 kb DNA ladder通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Gold view核酸染色劑進行染色，電泳儀上恒壓150 V電泳1.5 h，在透射紫外燈下觀察照相。

[HT5F]1.2.3 數(shù)據(jù)處理 統(tǒng)計試驗擴增引物在瓊脂糖凝膠上條帶顯示的位置，有條帶顯示記為1，沒有條帶顯示記為0。統(tǒng)計數(shù)據(jù)輸入Excel表格，建立ISSR擴增譜帶矩陣數(shù)據(jù)庫，利用POPGENE 32軟件分析遺傳多樣性，對每一條引物擴增結(jié)果建立二元數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計總位點數(shù)和多態(tài)性位點數(shù)并構(gòu)建指紋圖譜。對此0、1 矩陣進行分析，分析指標有多態(tài)位點百分率(percentage of polymorphic bands， PPB)、觀測等位基因數(shù)(observed number of alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，Ne)、Nei′s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、基因多樣性指數(shù)、遺傳分化系數(shù)、遺傳距離與遺傳相似度。利用NTSYSpc 2.10e軟件進行Jaccard相似性系數(shù)計算，并作出聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取效果

利用DNA提取試劑盒提取18份櫻屬材料的DNA,結(jié)果均是一條清晰的條帶(圖1)，無RNA污染、拖尾和彌散現(xiàn)象，利用紫外分光光度計測得DNA的質(zhì)量濃度為100～300 ng·μL-1。提取的DNA可以滿足ISSR-PCR反應對模板DNA的質(zhì)量要求。

注：M為1 kb DNA ladder；1～18為櫻花材料編號。Note: M.1 kb DNA ladder;1-18.material numbers.

2.2 ISSR引物篩選與擴增結(jié)果

從表2可知，對100條ISSR引物進行篩選，最終選出12條條帶清晰、明亮度好、多態(tài)性豐富的引物，在所有引物的占比為12%。18份櫻屬材料共擴增出144個重復性好、清晰穩(wěn)定的位點，其中多態(tài)性位點數(shù)135個，占總位點數(shù)的93.75%；各引物擴增出的位點數(shù)在10～15個之間，平均12個位點；多態(tài)性位點數(shù)在9～13個之間，平均11.25個；各引物擴增結(jié)果的PPB在84.62%～100%之間，平均為93.75%。綜上可得，12條ISSR引物均能擴增出高多態(tài)性的位點，由此顯示18份櫻屬材料具有豐富的多態(tài)性。從圖2可知，各引物檢測出的DNA片段大小范圍在300～1 500 bp之間，說明櫻花有適中長度的基因組。

表2 優(yōu)選出的12條ISSR的引物擴增Table 2 Amplification of the 12 ISSR optimal primers

注：M為100 bp DNA ladder；1～18為櫻花材料編號。Note: M.1k bp DNA ladder, 1-18.material numbers.

2.3 遺傳多樣性分析

PPB是衡量植物種群間遺傳變異水平的重要指標，如果一個植物種群的PPB值高則說明該種群能夠更好地適應當?shù)丨h(huán)境，能繁衍下去；若PPB值低則說明其環(huán)境適應能力較弱，有滅絕的可能性，需要及時對其采取適當?shù)谋Ｗo措施[21]。18份櫻屬材料的PPB差異性較小，PPB值在84.62%～100%之間，平均為93.75%，說明這18份櫻屬材料的適應性強，遺傳多樣性豐富，遺傳基礎較寬，在福建省漳平市有較好的適應力。利用POPGENE 32軟件分別對18份櫻屬材料的遺傳多樣性進行總體和單獨分析。結(jié)果顯示：18份櫻花供試材料Na值為1.979 2，Ne值為1.603 3，Nei′s遺傳多樣性指數(shù)為0.347 8，Shannon多樣性指數(shù)為0.518 2，顯示了供試材料間豐富的遺傳多樣性。

2.4 親緣關(guān)系分析

由表3可知，18份櫻屬材料間的遺傳相似性系數(shù)在0.453 2～0.833 3之間，平均為0.633 7，遺傳距離在0.182 3～0.765 1之間，平均為0.462 7。其中‘一葉櫻’和‘松月’兩個品種的遺傳相似性系數(shù)最大，值為0.833 3，說明兩者的親緣關(guān)系較近，福建山櫻花和‘八重彼岸’的遺傳相似性系數(shù)最小，值為0.453 2，說明兩者存在較大的遺傳差異。

表3 18份櫻屬材料間的遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離Table 3 Similarity coefficient matrix and genetic distance of 18 Cerasus materials

2.5 聚類分析

基于ISSR擴增結(jié)果，按照非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA)聚類進行遺傳關(guān)系分析，得到18份櫻屬材料的親緣關(guān)系樹狀圖(圖3)。從圖3可知，設定遺傳相似性系數(shù)為0.589 9時，群體可分為4個類群(Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ、 Ⅳ)，其中類群Ⅰ有9份櫻屬材料，類群Ⅱ有8份櫻屬材料，‘飛寒櫻’和‘八重紅彼岸’分別歸為一個類群，說明這兩個材料與其他材料的親緣關(guān)系較遠。當遺傳相似性系數(shù)為0.701 1時，群體則分為12個類群，差異數(shù)為8個，在遺傳相似性系數(shù)變化程度較小時，聚類差異明顯，說明18份櫻屬材料的遺傳多樣性豐富。

注：1～18為櫻花材料編號。Note: 1-18.material numbers.圖3 18份櫻屬材料的聚類圖Figure 3 UPGMA dendrogram for 18 Cerasus materials

2.6 主坐標分析

基于18份櫻屬材料的遺傳相似性系數(shù)，利用NTSYSpc軟件進行主坐標分析，第一、第二、第三主坐標的貢獻率分別為16.17%、11.27%和10.14%。對18份櫻屬材料做主坐標分析并構(gòu)建二維散點圖(圖4) ，散點分布規(guī)律與聚類分析得出的結(jié)果基本一致，只有11號‘染井吉野’品種在散點分布上與聚類分析中的規(guī)律有一些差異。在UPGMA聚類中，‘染井吉野’品種聚于類群Ⅱ中，而主坐標分析結(jié)果卻顯示該品種與亞類群Ⅲ中‘飛寒櫻’親緣關(guān)系更近，這種差異的出現(xiàn)可能由于在主坐標分析中還有第四、第五等其他貢獻值的影響。

注：1～18為櫻花材料編號。Note: 1-18.material numbers.圖4 18份櫻屬材料的主坐標分析圖Figure 4 Principal coordinate analysis for 18 Cerasus materials

2.7 DNA指紋圖譜的構(gòu)建

通過對篩選出的12個ISSR引物，發(fā)現(xiàn)引物UBC808和UBC835兩者對18份櫻屬材料能夠完全鑒別出來，有較好的鑒別效果。將擴增結(jié)果進行數(shù)字轉(zhuǎn)化(有條帶記為1， 無條帶記為0)，形成了特有的分子身份證編碼，構(gòu)建出18份櫻屬材料的DNA指紋圖譜(表4)，可用于種質(zhì)資源的分類與鑒定。

表4 引物UBC808和UBC835構(gòu)建18份櫻屬材料的DNA指紋圖譜Table 4 DNA fingerprint of 18 Cerasus materials based on primer UBC808 and UBC 835

3 討論與結(jié)論

在遺傳多樣性研究、品種鑒定、輔助育種等方面，分子標記技術(shù)具有重要意義[22]。18份櫻屬材料ISSR標記結(jié)果顯示，12條ISSR引物共擴增出144個多態(tài)性位點，其中多態(tài)性位點135個，多態(tài)性位點占93.75%，平均Nei′s遺傳多樣性指數(shù)為0.348 7，表明所選的櫻花材料間存在豐富的遺傳變異，并且ISSR分子標記在櫻花材料間的擴增位點多態(tài)性主要由種間的差異引起，可有效地反映種間的親緣關(guān)系,這與其他櫻屬的分子標記技術(shù)應用研究相符合。如蔣冬月等[16]和林立等[17]的研究中，PPB值分別為93.58%和94.03%，說明具有豐富的多態(tài)性和較高的區(qū)分度。而在其他分子標記技術(shù)應用研究里，陳芳等[23]、?Zetal[24]和蘇倩[25]運用RFLP、SSR和RAPD等分子標記技術(shù)對櫻屬的植物進行了遺傳多樣性分析，均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。因此，以ISSR為主的分子標記法可以作為櫻花種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析的有效手段。

在18份櫻屬材料的聚類分析和主坐標分析中，各材料間的遺傳相似性系數(shù)差異較大，選優(yōu)材料與母本的遺傳相似性系數(shù)并未十分相近，說明通過雜交等育種手段培育后，櫻屬材料的遺傳多樣性高，但從總體而言，通過聚類分析和主坐標分析等數(shù)據(jù)分析手段，能夠清楚地區(qū)分各材料的親緣關(guān)系類群，而選優(yōu)材料在櫻花種或品種間的區(qū)分和鑒別上有著相當大的困難，同一地區(qū)內(nèi)由于栽培人員的多年人工培育，很多疑似新品種和選優(yōu)材料在外形上十分相似，只有在花瓣或葉片上有細微差別，已經(jīng)無法確認其親本以及親緣關(guān)系。在本次研究中，采集的福建省漳平市各苗木基地的18份櫻屬材料，其中有6份是選優(yōu)材料，通過分子標記進行親緣鑒定，研究中UPGMA聚類分析的結(jié)果從分子生物學層面對18份材料進行了有效的區(qū)分和鑒別。選優(yōu)1號、選優(yōu)2號、選優(yōu)3號和‘河津’、福建山櫻花遺傳相似性系數(shù)較高，在花型、花色上存在較大相似性，但花期略有不同，且存在連續(xù)性，能夠為櫻花觀賞期的延長提供可能；選優(yōu)4號和‘大漁櫻’遺傳相似度較高，但選優(yōu)材料在花色上更加鮮艷亮麗，花期更長，這對國外引進品種的本土化品種改良有一定參考價值；而‘河津’、‘大漁櫻’和福建山櫻花又有著較高遺傳相似性，與國內(nèi)櫻花種有較近親緣關(guān)系的國外引進品種，選育出優(yōu)良品種的可能性更大；與選優(yōu)5號、選優(yōu)6號有較高遺傳相似性系數(shù)的‘染井吉野’和‘陽光櫻’在福建省漳平市生長情況比選優(yōu)品種更差，說明國外引進品種與福建山櫻花雜交后的選優(yōu)材料在適應性上可能更強。從表型難以準確鑒別的選優(yōu)材料，通過遺傳相似性分析和聚類分析可以較好地區(qū)分出櫻花不同種或品種，為以后國內(nèi)櫻花的良種選育、輔助育種、新品種鑒定、品種命名和難以分辨的品種鑒別提供了有力證據(jù)，還能夠為國內(nèi)櫻花的培育者在今后更加規(guī)范的品種商品化、產(chǎn)業(yè)化道路上提供理論依據(jù)。

櫻花在我國的種質(zhì)資源分布也十分豐富，據(jù)統(tǒng)計，櫻屬植物達到48種[26]，國內(nèi)主要的觀賞櫻花還是以日本引進為主，而國內(nèi)櫻花種類在我國各省份已經(jīng)有較多生長優(yōu)良、觀賞價值高的品種種源地，如福建、江西、廣東等省。但我國的櫻花產(chǎn)業(yè)起步晚，品種鑒定、良種選育、品種改良等能力還不夠，嚴重影響了國內(nèi)櫻花品種商品化、產(chǎn)業(yè)化的推廣。本研究利用了ISSR分子標記技術(shù)，在分子生物學水平上揭示了同一種源地不同櫻花材料具有豐富的遺傳多樣性，區(qū)分和鑒別了不同國內(nèi)櫻花材料的親緣關(guān)系，證明了ISSR分子標記法對于分析國內(nèi)櫻花的遺傳多樣性一個效果較好方法。因此，可利用ISSR分子標記法對國內(nèi)各個櫻花種源地的品種進行全面分析，查清遺傳關(guān)系，建立科學、規(guī)范的命名標準和品種資源信息庫，開展國內(nèi)櫻花的資源開發(fā)、良種選育、優(yōu)良品種應用、品種產(chǎn)業(yè)化等工作。