球孢白僵菌和金龜子綠僵菌對紅火蟻工蟻的致病力測定

吳志鵬，童應華

(福建農林大學林學院，福建 福州350002)

紅火蟻(SolenopsisinvictaBuren)隸屬于膜翅目(Hymenoptera)蟻科(Formicidae)切葉蟻亞科(Mymicinae)火蟻屬(Solenopsis)[1]，是世界自然保護聯(lián)盟公布的世界100種最具危害性的外來入侵種之一[2]，原產(chǎn)于南美洲的巴西、阿根廷、巴拉圭一帶，先后入侵到美國、新西蘭和澳大利亞等地區(qū)[3-4]。在中國，2003年臺灣首次報道紅火蟻入侵[5]，截止到2019年5月，已在國內超過12個省(區(qū)、市)發(fā)現(xiàn)紅火蟻入侵[6]。該蟻習性兇猛、繁殖力強，對入侵地區(qū)的農林業(yè)生產(chǎn)、居民人身安全等造成了嚴重的威脅與危害，對入侵地節(jié)肢動物物種多樣性及生態(tài)系統(tǒng)造成難以修復的影響[7]。因此，如何預防紅火蟻入侵和有效控制其種群成為亟需解決的科學問題。

目前，紅火蟻的防治主要采用毒餌誘殺或灌藥毒殺等化學方法防治[8]，該方法在一定程度上控制了其種群數(shù)量，但是使用化學農藥易傷害非靶標生物，破壞生態(tài)平衡[9]。采用熱水澆灌蟻巢，肥皂水浸泡蟻巢等物理防治方法耗時耗力，防治效率低[10]。于是低毒高效的生物防治方法引起人們的廣泛關注，美國利用病原真菌防治紅火蟻已取得了一定成效[11-12]，國內學者開展了白僵菌、綠僵菌和淡紫擬青霉(PaecilomyceslilacinusThom)對紅火蟻致病性的研究，發(fā)現(xiàn)其對紅火蟻均有一定的致病力[13-14]。本研究應用11株球孢白僵菌和9株金龜子綠僵菌對紅火蟻工蟻進行致病力測定，旨為尋找對紅火蟻具有高致病力的菌株資源，為利用蟲生真菌防治該蟲奠定應用基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲

供試紅火蟻采自福建省福州市(N26°05′14.3″，E119°13′42.7″)。將野外采集的紅火蟻蟻巢帶回實驗室，采用水滴法分離蟻群。分離后的蟻群飼養(yǎng)于30 cm×20 cm×20 cm的養(yǎng)蟲盒內，養(yǎng)蟲盒內壁均勻涂上滑石粉，以防其逃逸，盒內放置用石膏搭建的人工蟻巢，用紗布遮蓋養(yǎng)蟲盒。將裝有紅火蟻的養(yǎng)蟲盒置于(25±1) ℃、相對濕度65%～75%、光照12L∶12D下的培養(yǎng)箱內以水試管持續(xù)供水，采用蜂蜜水、火腿腸和油炸蠶豆飼養(yǎng)。待紅火蟻種群穩(wěn)定后，挑選大小基本一致的健康工蟻進行試驗。

1.2 供試菌株

供試的11株球孢白僵菌和9株金龜子綠僵菌菌株信息見表 1。

表1 供試菌株來源Table 1 The origin of tested strains

1.3 試驗方法

1.3.1 孢子懸液的制備 將白僵菌和綠僵菌接菌于PDA斜面培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)充分產(chǎn)孢后，使用前提前測定各菌株孢子萌發(fā)率，選擇48 h內孢子萌發(fā)率大于90%的產(chǎn)孢菌株，用含0.01%吐溫-80的無菌水洗脫孢子，置于振蕩器上振蕩20 min(150 r·min-1)。用血球計數(shù)板計數(shù)，將各菌株配制成不同濃度的孢子懸液，備用。

1.3.2 高致病力菌株的篩選 選取大小基本一致的紅火蟻工蟻挑入干凈保鮮盒內，隨后向保鮮盒內加15 mL 1.0×107個孢子·mL-1孢子懸液，浸5 s后立即取出，放入墊有濕潤濾紙的干凈保鮮盒內，以棉球浸漬10%葡萄糖水喂食，盒上打10個直徑為0.5 mm的小孔，接菌后置于25 ℃，相對濕度90%人工氣候箱內飼養(yǎng)。每一菌株為1個處理，每個處理3個重復，每個重復50頭工蟻，以浸含0.01%吐溫-80的無菌水為對照。每天觀察、統(tǒng)計死亡的紅火蟻數(shù)量，并將死蟲及時挑出，放于墊濕潤無菌濾紙的培養(yǎng)皿內，25 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察死蟲上的子實體生長情況。連續(xù)觀察統(tǒng)計10 d。

1.3.3 高致病力菌株的毒力測定 選擇對紅火蟻死亡率和僵蟲率較高，且致死速度較快的菌株，分別以1×104、1×105、1×106、1×107和1×108個孢子·mL-1的孢子懸液接菌，接菌方法、接菌后處理和觀察統(tǒng)計方法同1.3.2。每個濃度1個處理，每個處理3個重復，每個重復50頭試蟲。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以Excel 2010處理原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，并以鄧肯氏新復極差法進行多重比較。用DPS7.05對時間-劑量-死亡率(time-dose-mortality)模型進行分析[15]。

2 結果與分析

2.1 紅火蟻工蟻感染白僵菌與綠僵菌的病癥

紅火蟻工蟻感染白僵菌與綠僵菌的癥狀如圖1。紅火蟻工蟻感染各菌株初期，活動減弱，身體弓曲，死亡后身體完全蜷縮，經(jīng)恒溫保濕培養(yǎng)2～3 d后，各體節(jié)間有白色菌絲長出，白僵菌菌絲生長快于綠僵菌，4～5 d后白僵菌侵染的死蟲節(jié)間產(chǎn)生大量白色分生孢子，呈團狀分布，綠僵菌侵染的蟲體節(jié)間產(chǎn)生大量深綠色孢子，呈簇狀分布。

(a)白僵菌感染 Infected by B. bassiana

2.2 各菌株對紅火蟻工蟻的致病力

2.2.1 白僵菌菌株對紅火蟻工蟻的致病力 以濃度1×107個孢子·mL-1的孢子懸液接菌紅火蟻工蟻，分析處理10 d后紅火蟻工蟻的累計死亡率動態(tài)。由圖2可見，在接菌后3～5 d紅火蟻工蟻死亡率快速上升，隨后趨于平穩(wěn)。接菌BSX-JC、BLK、Bn-001、BQL-YJ后紅火蟻工蟻累計死亡率較低。統(tǒng)計分析各菌株接菌后10 d 紅火蟻工蟻的死亡情況(表2)。結果表明各菌株對紅火蟻工蟻均有致病力，其中BSX-PC菌株致病力最強，接菌后紅火蟻工蟻的校正死亡率和僵蟲率分別為(67.14±0.22)%和(52.31±0.31)%，致死中時(median lethal time， LT50)(5.64±0.52) d。BQL-YJ菌株處理致病力最弱，接菌后紅火蟻工蟻累計死亡率僅(26.50±0.77)%，與對照組無顯著差異，且僵蟲率僅(1.99±0.13)%，顯著低于其它菌株。由此可見，BSX-PC菌株對紅火蟻工蟻有較強致病力。

表2 白僵菌各菌株處理10 d時紅火蟻工蟻的致死效果Table 2 Lethal effects of different B. bassiana strains on S. invicta workers at the 10th day after the treatment

2.2.2 綠僵菌對紅火蟻工蟻的致病力 以濃度1×107個孢子·mL-1的孢子懸液接菌紅火蟻工蟻，分析處理10 d后紅火蟻工蟻的累計死亡率動態(tài)。由圖3可見，接菌后2 d各組死亡率相近，接菌后3～5 d，各處理的死亡率上升速度較快，隨后趨于平穩(wěn)。統(tǒng)計分析各菌株處理后10 d紅火蟻工蟻的死亡情況(表3)。結果表明各菌株對紅火蟻工蟻致病力差異較大，9株菌株中，MaWys-01菌株致病力最強，接菌后紅火蟻工蟻的校正死亡率和僵蟲率顯著高于其它各菌株處理，分別為(81.93±0.94)%和(64.52±0.56)%，且LT50最短，為(4.78±0.46) d。而Maxm-05菌株致病力最弱，接菌后紅火蟻工蟻的校正死亡率和僵蟲率分別為(35.13±1.25)%和(28.10±0.41)%，致死時間最長。由此可見，MaWys-01菌株對紅火蟻工蟻有較強的致病力。

圖2 白僵菌各菌株處理后紅火蟻工蟻累計死亡率動態(tài)Figure 2 Dynamic of cumulative mortality of S. invicta workers treated by different B. bassiana strains

圖3 綠僵菌各菌株處理后紅火蟻工蟻累計死亡率動態(tài)Figure 3 Dynamic of cumulative mortality of S. invicta workers treated by different M. anisopliae strains

表3 綠僵菌各菌株處理10 d時紅火蟻工蟻的致死效果Table 3 Lethal effects of different M. anisopliae strains on S. invicta workers at the 10th day after the treatment

2.3 白僵菌BSX-PC不同濃度對紅火蟻工蟻的致病力

分析白僵菌BSX-PC不同濃度孢子懸液對紅火蟻工蟻的致病力。由表4可知，各濃度處理紅火蟻工蟻校正死亡率之間存在顯著差異，隨著處理濃度的增加校正死亡率逐漸增大，以1×108個孢子·mL-1接菌后10 d紅火蟻工蟻校正死亡率最大，為(79.59±0.59)%。通過時間-劑量-死亡率模型估計，各參數(shù)估計值見表5。經(jīng)Hosmer & Lemeshow檢驗得到卡方值P=0.533>0.05，模型擬合成功。劑量效應參數(shù)β=0.341 5，說明各濃度的孢子懸液對紅火蟻均有一定的致死效果。在接菌后3～5 d，γi較前后都相差較大，可知接菌后3～5 d紅火蟻死亡數(shù)較多。

表4 不同時段白僵菌BSX-PC菌株對紅火蟻工蟻的LC50Table 4 Median lethal concentration (LC50)on different time of the B. bassiana BSX-PC strain against S. invicta workers

表5 BSX-PC菌株對紅火蟻工蟻的時間-劑量-死亡率模型Table 5 The time-dose-mortality model of the BSX-PC strain against S. invicta workers

2.4 綠僵菌MaWys-01不同濃度對紅火蟻工蟻的致病力

分析綠僵菌MaWys-01不同濃度孢子懸液對紅火蟻工蟻的致病力。由表6可知，接菌后3、6和10 d，其致死中濃度(median lethal concentration， LC50)分別為7.59×108、2.42×105和5.90×104個孢子·mL-1。進一步分析其時間-劑量-死亡率模型，各參數(shù)估計值見表7。經(jīng)Hosmer & Lemeshow檢驗得到卡方值P=0.076>0.05，說明模型擬合無顯著異質性存在，即擬合成功。劑量效應參數(shù)β=0.477 5，說明MaWys-01各濃度的孢子懸液對紅火蟻均有一定的致死效果。處理后第4天的時間效應參數(shù)值最大，可知第4天是紅火蟻的死亡高峰期，此估計與試驗觀察情況一致。

表6 不同時段綠僵菌MaWys-01菌株對紅火蟻工蟻的LC50Table 6 Median lethal concentration (LC50) on different time of the M. anisopliae MaWys-01 strain against S. invicta workers

表7 MaWys-01菌株對紅火蟻工蟻的時間-劑量-死亡率模型Table 7 The time-dose-mortality model of the MaWys-01 strain against S. invicta workers

3 討論與結論

研究發(fā)現(xiàn)，在11株白僵菌和9株綠僵菌菌株中，白僵菌BSX-PC和綠僵菌MaWys-01對紅火蟻工蟻致病力最強。以濃度1×107個孢子·mL-1的孢子懸液接后10 d，BSX-PC菌株對紅火蟻工蟻的校正死亡率和僵蟲率分別為(67.14±0.22)%和(52.31±0.31)%；MaWys-01菌株對紅火蟻工蟻的校正死亡率和僵蟲率分別為(81.93±0.94)%和(64.52±0.56)%；BSX-PC和MaWys-01菌株接種后6 d的LC50分別為1.01×106和2.42×105個孢子·mL-1，兩株菌株對紅火蟻工蟻致死效應最強的時間均是接菌后3～5 d。進一步測定兩個菌株不同濃度對紅火蟻工蟻的致病力，所有濃度下綠僵菌MaWys-01的致病力都略高于白僵菌BSX-PC，以濃度1×108個孢子·mL-1的孢子懸液接菌后10 d，綠僵菌MaWys-01對紅火蟻的校正死亡率達99.20%。綜合分析，白僵菌BSX-PC及綠僵菌MaWys-01在紅火蟻生物防治中有較大應用潛力。

王磊等[16]研究了3株金龜子綠僵菌對紅火蟻的致病力，以濃度1×108個孢子·mL-1接菌，M09菌株致病力最強，接菌后10 d紅火蟻工蟻的累計死亡率為73.3%；許齊愛等[17]研究了黃綠綠僵菌(MetarhiziumflavovirideGams & Roszypal)不同菌株對紅火蟻大型和小型工蟻的致病力，致病力最強的SM076菌株在1×108個孢子·mL-1濃度下，LT50分別為6.14 d和7.81 d，LT50較MaWys-01長3.51 d；以上差異的原因可能是不同菌株對紅火蟻的致病力不同所致。楊佳后等[18]篩選4株白僵菌對紅火蟻的致病力研究，5974菌株以濃度1×108個孢子·mL-1接菌，10 d的累計校正死亡率為88.3%，LC50為2.4×106個孢子·mL-1，5974菌株10 d的累計校正死亡率要略大于BSX-PC的79.59%，但是LC50大于BSX-PC的1.52×105個孢子·mL-1。這說明BSX-PC菌株在前期對紅火蟻的致病力強于5974菌株；呂利華等[13]篩選出的白僵菌Bb02和Bb03以濃度1×108個孢子·mL-1接菌，10 d的累計死亡率接近100%，與本試驗篩選的菌株MaWys-01累計死亡率相似。同時他們所篩選的淡紫擬青霉Pl04菌株15 d的累計死亡率只有69.84%，對紅火蟻的致病力較低。李軍等[19]使用白僵菌與氯化鈉復配對紅火蟻致病力效果顯著高于單獨使用白僵菌，并使用巢內注射式生物防控裝置進行了相關田間防治試驗，在防治30 d后紅火蟻減退率高達98.35%。本試驗可參考其研究思路進行后續(xù)研究，探討不同鹽溶液與綠僵菌的復配對紅火蟻的致病力的影響，進一步完善田間防治試驗。