• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    嚴(yán)格厭氧嗜熱纖維梭狀芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶條件的優(yōu)化

    2020-01-13 02:11:42章亭洲朱廷恒王騰浩趙艷沈煒
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年22期
    關(guān)鍵詞:發(fā)酵罐補(bǔ)料梭菌

    章亭洲,朱廷恒,王騰浩,趙艷,沈煒

    1(浙江科峰生物技術(shù)有限公司,浙江 海寧, 314423) 2(浙江工商大學(xué),浙江 杭州, 310018)

    纖維素是自然界中含量最多的一類碳水化合物,也是最廉價(jià)的可再生資源,纖維素主要存在植物細(xì)胞壁中[1]。纖維素酶是能催化水解纖維素生成葡萄糖的一類糖苷水解酶,又稱纖維素酶系[2]。纖維素酶系根據(jù)其功能的差異,主要分為三大類,分別為內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glcanohdrolase,EG)、外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase,CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase,BG),它們?cè)诶w維素的水解過程中協(xié)同作用,高效降解纖維素。EG隨機(jī)水解纖維素非結(jié)晶區(qū)內(nèi)部的糖苷鍵,主要產(chǎn)生纖維糊精和低聚糖。CBH從纖維素鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖。BG水解纖維二糖和寡糖以釋放可發(fā)酵的葡萄糖[2,3]。纖維素酶廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)乙醇、食品、紡織、飼料等行業(yè),我國有豐富的纖維素資源,開發(fā)高效的纖維素酶具有重要的應(yīng)用價(jià)值[4]。

    纖維素酶廣泛存在于微生物中,多種產(chǎn)纖維素酶活性較高的微生物已被發(fā)現(xiàn)和工業(yè)化應(yīng)用[5]。因真菌產(chǎn)纖維素酶系較全,分解纖維素能力較強(qiáng),國內(nèi)外對(duì)降解纖維素菌研究多集中于真菌,比較典型的有木霉菌屬木酶屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)等[2-6]。

    嗜熱纖維梭狀芽孢桿菌(Clostridiumthermocellum,以下簡稱嗜熱纖維梭菌,俗稱為梭熱桿菌)是一種嗜熱厭氧細(xì)菌,分泌大量纖維素酶,是目前自然界中已知的降解纖維素最高效的微生物之一,是利用纖維素生產(chǎn)生物能源和化學(xué)品的理想菌株[7-8]。嗜熱纖維梭菌中含有催化纖維素降解的纖維小體,它是由若干纖維素酶活性的催化單元與無催化活性的支架蛋白結(jié)合形成的復(fù)合物,其獨(dú)特的結(jié)構(gòu),使得它可以比真菌纖維素酶更緊密地結(jié)合到纖維素表面,從而高效降解底物[9-12]。嗜熱纖維梭菌產(chǎn)生的纖維素酶耐熱性好,但是由于熱纖梭菌是一種嚴(yán)格的厭氧菌,培養(yǎng)條件極其苛刻,分泌纖維素酶必須在高度厭氧的條件下進(jìn)行,且酶產(chǎn)量相對(duì)較低,我國目前尚未實(shí)現(xiàn)嗜熱纖維梭菌纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn),也很少見到有關(guān)該菌發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝優(yōu)化等基礎(chǔ)研究報(bào)道。

    本文對(duì)從美國羅切斯特大學(xué)引進(jìn)的嗜熱纖維梭菌進(jìn)行了發(fā)酵工藝優(yōu)化研究。

    1 材料與方法

    1.1 菌株

    嗜熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)ATCC 27405菌株[13]:由美國羅切斯特大學(xué)化學(xué)工程系J. H. David Wu教授提供。

    1.2 培養(yǎng)基

    基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g):KH2PO41.5;K2HPO42.9;尿素2.1;MgCl2·6H2O 1.0;CaCl2·2H2O 0.15;FeSO4·7H2O 0.002 5;鹽酸胱氨酸1.0; Resazurin 2.0mg;纖維二糖5.0;嗎啉丙烷磺酸(morpholinopropane sulfonic acid,MOPS) 10.0;酵母提取物 5.0;二水檸檬酸鈉3.0。

    種子培養(yǎng)基(g/L):纖維二糖10,玉米漿12,檸檬酸三鉀鹽2,一水檸檬酸1.25,Na2SO41,KH2PO41,NaHCO32.5,NH4Cl 1.5,尿素5,酵母抽提物l,MgCl2·6H2O 50,F(xiàn)eCl2·4H2O 0.1,MgCl20.2,一水半胱氨酸鹽酸鹽1,二鹽酸吡哆胺0.02,對(duì)氨基苯甲酸0.004,D-生物素0.002,VB120.02,VB10.002,pH值自然。115 ℃濕熱滅菌20 min。

    發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):纖維二糖10,微晶纖維素10,玉米漿12,檸檬酸三鉀鹽2,一水檸檬酸1.25,Na2SO41,KH2PO41,NaHCO32.5,NH4Cl 1.5,尿素5,酵母抽提物1,MgCl2·6H2O 50,FeCl2·4H2O 0.1, CaCl2·2H2O 0.2,一水半胱氨酸鹽酸鹽1,二鹽酸吡哆胺0.02,對(duì)氨基苯甲酸0.004,D-生物素0.002,VB120.02,VB10.002,pH值自然。115℃濕熱滅菌20min。

    1.3 纖維素酶酶活測定

    酶活測定(濾紙酶活)參考文獻(xiàn)進(jìn)行[14]。

    取50 mg濾紙(剪成1 cm×6 cm的濾紙條),加1 mL pH 4.8的 50 mmol/L檸檬酸緩沖液,加入適當(dāng)稀釋含酶液(發(fā)酵上清液)0.5 mL,50℃反應(yīng)1 h,加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液,沸水浴5 min,迅速冷卻至室溫,加入20 mL去離子水,混合均勻后測定540 nm處的吸光值??瞻讓?duì)照對(duì)應(yīng)加入500 μL檸檬酸緩沖液(50 mmol/L,pH 4.8)。以上酶活均扣除發(fā)酵液中的還原糖后計(jì)算酶活力,發(fā)酵培養(yǎng)基中的殘留乳糖通過高效液相色譜測定:Bio-Rad HPX-87P 色譜柱,柱溫30 ℃,流動(dòng)相為5 mmol/L的稀硫酸,檢測器為示差檢測器。

    酶活定義為每分鐘水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為1個(gè)活力單位。

    1.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

    1.4.1 菌株活化

    采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行菌株活化。將配制好的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基煮沸驅(qū)氧,而后用定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中,每支10 mL,并插入通氮?dú)獾拈L針頭以排除氧氣。此時(shí)可以清楚地看到培養(yǎng)基內(nèi)加入的氧化還原指示劑刃天青由藍(lán)到紅最后變成無色,說明試管內(nèi)已成為無氧狀態(tài),然后,蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋,121℃滅菌20 min后備用。

    將嗜熱纖維梭菌接種到培養(yǎng)管的培養(yǎng)基中,然后將培養(yǎng)管放入60℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 h。

    1.4.2 發(fā)酵條件的探索

    培養(yǎng)管中活化培養(yǎng)后的菌株接種到裝液量60 mL的100 mL厭氧培養(yǎng)瓶中進(jìn)行下列不同發(fā)酵條件的研究。對(duì)發(fā)酵溫度、發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH值分別進(jìn)行單因素試驗(yàn),尋找最適條件。

    設(shè)置不同的發(fā)酵溫度,分別為30、40、50、55、60 ℃,發(fā)酵72 h,發(fā)酵結(jié)束后測定纖維素酶活。

    設(shè)置不同的培養(yǎng)時(shí)間,分別為24、48、60、72、84、96 h,60℃培養(yǎng),發(fā)酵結(jié)束后測定纖維素酶活。

    設(shè)置不同的培養(yǎng)基初始pH,分別為5.5、6、6.5、7、7.5、8,發(fā)酵結(jié)束后測定纖維素酶活。

    1.5 發(fā)酵工藝探索

    1.5.1 放大工藝下的纖維素酶發(fā)酵法

    將活化的菌株按照2%的接種量轉(zhuǎn)接到50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,55℃恒溫培養(yǎng)24 h,得到一級(jí)種子液。

    發(fā)酵培養(yǎng)基裝入5 L發(fā)酵罐,裝液量3 L,滅菌結(jié)束后,向發(fā)酵罐通入氮?dú)?,除去培養(yǎng)基及罐內(nèi)氧氣。調(diào)節(jié)培養(yǎng)pH恒定為7,罐溫控制為55℃,然后接入一級(jí)種子液,停止通氣,間歇式攪拌發(fā)酵。保持發(fā)酵罐內(nèi)無氧狀態(tài),厭氧發(fā)酵。

    1.5.2 補(bǔ)料分批發(fā)酵制備纖維素酶

    1.5.2.1 補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)的確定

    將活化菌株接種到種子培養(yǎng)基中,然后以 2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,得到一級(jí)種子液,將種子液以5%的接種量接種到裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中,厭氧培養(yǎng),罐溫控制為55℃,調(diào)節(jié)pH為7,間歇式攪拌。根據(jù)菌體生長情況和糖耗情況,分別在發(fā)酵開始后的16、20、24 h開始向發(fā)酵體系中緩慢添加纖維二糖溶液,流速為6 mL/h,上述纖維二糖溶液質(zhì)量濃度為200 g/L,比較產(chǎn)酶情況。

    1.5.2.2 補(bǔ)料碳源的確定

    將活化的菌株接種到種子培養(yǎng)基中,然后以2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,得到一級(jí)種子液,將種子液以5%的接種量接種到裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中,厭氧培養(yǎng),罐溫控制為55℃,調(diào)節(jié)pH為7,間歇式攪拌。發(fā)酵16~48 h,分別添加纖維二糖、微晶纖維素、木聚糖溶液,流速為6 mL/L,上述碳源溶液質(zhì)量濃度為200 g/L,發(fā)酵至60 h,比較產(chǎn)酶情況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

    嗜熱纖維梭菌是嚴(yán)格厭氧菌,進(jìn)行發(fā)酵條件研究時(shí),保證發(fā)酵的無氧條件,厭氧發(fā)酵。

    不同發(fā)酵溫度下的研究結(jié)果表明,嗜熱纖維梭菌在50~60℃的條件下相對(duì)酶活較高,可達(dá)90%以上,其中55℃時(shí)相對(duì)酶活力最高(圖1)。此溫度與報(bào)道的該菌的嗜熱特征和產(chǎn)纖維素酶的條件相似,因此,利用該菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的最適溫度應(yīng)為55℃。

    圖1 發(fā)酵溫度對(duì)酶活影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on enzymatic activity

    不同發(fā)酵時(shí)間的結(jié)果表明,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,酶活力呈上升趨勢,發(fā)酵至60 h酶活力達(dá)到峰值,96 h酶活開始下降(圖2)。所以發(fā)酵進(jìn)行60 h后停止,可以大大節(jié)約發(fā)酵成本。

    圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活影響Fig.2 Effect of fermentation time on enzymatic activity

    培養(yǎng)基不同初始pH值的研究結(jié)果表明,當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為6.5~8時(shí),相對(duì)酶活可達(dá)90%以上,最適培養(yǎng)基pH為7(圖3)。按照上述優(yōu)化條件即在55℃,初始培養(yǎng)基pH為7的條件下發(fā)酵60 h,測得酶活為5.12 U/mL,為未優(yōu)化的1.5倍。

    圖3 培養(yǎng)基初始pH對(duì)酶活影響Fig.3 Effect of initial fermentation pH on enzymatic activity

    2.2 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

    2.2.1 放大工藝下的纖維素酶發(fā)酵法

    嗜熱纖維梭菌是嚴(yán)格厭氧菌,發(fā)酵放大工藝研究時(shí)維持發(fā)酵罐內(nèi)無氧條件,厭氧發(fā)酵。將保藏的菌株接種到種子培養(yǎng)基中,然后,以 2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,得到一級(jí)種子液,將種子液以5%的接種量接種到裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中,厭氧培養(yǎng),罐溫控制為55℃,調(diào)節(jié)pH為7,間歇式攪拌。發(fā)酵60 h酶活為12.37 U/mL。結(jié)果表明,發(fā)酵罐的放大培養(yǎng)條件下,嗜熱纖維梭菌產(chǎn)纖維素酶酶活顯著高于厭氧瓶條件下的酶活。

    2.2.2 補(bǔ)料分批發(fā)酵制備纖維素酶的最佳時(shí)間

    首先研究了根據(jù)嗜熱纖維梭菌生長曲線和糖耗的關(guān)系,結(jié)果表明菌體在16 h后進(jìn)入指數(shù)生長期,生物量顯著增加,此時(shí)糖的利用率最大(圖4)。根據(jù)菌體生長和糖耗情況,確定了補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)。分別在發(fā)酵開始后的16、20、24 h開始向發(fā)酵體系中緩慢添加質(zhì)量濃度為200 g/L纖維二糖溶液,流速為6 mL/h。比較產(chǎn)酶情況,發(fā)現(xiàn)0~12 h糖耗和生長情況較緩慢,進(jìn)入16 h后,菌體快速生長和糖耗進(jìn)入快速消耗階段,所以選擇16、20、24 h作為補(bǔ)料點(diǎn)。通過比較了不同補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)酶情況,發(fā)現(xiàn)從16 h的點(diǎn)開始補(bǔ)料,酶活最高,達(dá)到16.38 U/mL(表1)。發(fā)酵48 h后,菌體到達(dá)穩(wěn)定期,糖耗變緩,因此,確定補(bǔ)料時(shí)間為16~48 h。

    圖4 嗜熱纖維梭菌生長和糖耗曲線Fig.4 Curve of growth and glucose use for Clostridium thermocellum

    表1 不同補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)對(duì)酶活影響Table 1 Effect of different time of carbon addition on enzymatic activity

    2.2.3 補(bǔ)料分批發(fā)酵制備纖維素酶的最佳碳源

    對(duì)幾種可能提高嗜熱纖維梭菌纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)生酶活的碳源進(jìn)行了研究。發(fā)酵16~48 h,分別添加質(zhì)量濃度為200 g/L的纖維二糖、微晶纖維素、木聚糖溶液,流速為6 mL/L,發(fā)酵60 h后,測定酶活。酶活結(jié)果分析比較發(fā)現(xiàn),添加纖維二糖的時(shí)候,酶活最高,達(dá)16.56U/mL(表2)。因此,纖維二糖為分批補(bǔ)料發(fā)酵條件下的最佳補(bǔ)料碳源。

    表2 不同碳源對(duì)酶活影響Table 2 Effect of different carbon sources on enzymatic activity

    3 結(jié)論

    纖維素的分解和利用是當(dāng)今世界研究熱點(diǎn)之一,可以用于生物基能源生產(chǎn)、新型生物工藝和功能產(chǎn)品開發(fā)等,但轉(zhuǎn)化效率很低,高效纖維素酶、纖維小體的研究和開發(fā)應(yīng)用是突破瓶頸的關(guān)鍵[15-16]。纖維素酶已在轉(zhuǎn)化利用含纖維素物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料、食品和飼料原料加工、造紙業(yè)、紡織業(yè)等多個(gè)行業(yè)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用[17-19]。目前纖維素酶研究主要集中于真菌,但由于細(xì)菌相對(duì)真菌來說生長速率較高,所產(chǎn)纖維素酶的熱穩(wěn)定性和堿穩(wěn)定性高,用細(xì)菌產(chǎn)生纖維素酶的優(yōu)勢正在引起更多研究者的關(guān)注[20-22]。

    嗜熱纖維梭菌是嗜熱厭氧細(xì)菌,產(chǎn)生纖維小體,纖維素酶具有耐高溫、催化活性高等明顯的優(yōu)勢[23-25],該菌產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件探索和優(yōu)化是利用其進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的前提。嗜熱纖維梭菌是嚴(yán)格厭氧菌,工業(yè)化生產(chǎn)條件要求苛刻,要確保發(fā)酵罐內(nèi)無氧條件,厭氧發(fā)酵。本文對(duì)該菌在發(fā)酵厭氧瓶水平上進(jìn)行了發(fā)酵條件探索,發(fā)現(xiàn)在55℃,初始培養(yǎng)基pH為7、發(fā)酵60 h為最佳條件,此時(shí)測得酶活為5.12 U/mL。此外,在放大的發(fā)酵罐水平上進(jìn)行了發(fā)酵工藝探索和優(yōu)化,根據(jù)菌體生長情況對(duì)分批發(fā)酵條件下的補(bǔ)料時(shí)間和添加碳源進(jìn)行了研究,放大和優(yōu)化后,該菌產(chǎn)纖維素酶的酶活由5.12 U/mL提高到16.56 U/mL,效果極顯著。研究結(jié)果為進(jìn)一步規(guī)?;墓I(yè)化生產(chǎn)降低成本和設(shè)計(jì)工藝提供了參考依據(jù)。

    猜你喜歡
    發(fā)酵罐補(bǔ)料梭菌
    餐廚廢水和固渣厭氧發(fā)酵試驗(yàn)研究
    反應(yīng)型冷補(bǔ)料與溶劑型冷補(bǔ)料路用性能對(duì)比研究
    丁酸梭菌的篩選、鑒定及生物學(xué)功能分析
    中國飼料(2021年17期)2021-11-02 08:15:10
    發(fā)酵罐不銹鋼換熱盤管泄漏失效分析
    精補(bǔ)料增重凈能對(duì)西雜肉牛育肥性能和成本的影響
    利用計(jì)算流體力學(xué)技術(shù)分析啤酒發(fā)酵罐構(gòu)型對(duì)溫度和流動(dòng)的影響
    本地白山羊和隆林山羊冬春季補(bǔ)料效果對(duì)比試驗(yàn)
    豬肉毒梭菌中毒癥的發(fā)生和診療方法
    30L發(fā)酵罐培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)高密度芽孢的研究
    廢舊鎂鉻磚再生料在RH浸漬管噴補(bǔ)料中的應(yīng)用
    亚洲人成网站在线观看播放| 美女视频免费永久观看网站| 日韩一区二区视频免费看| 久久鲁丝午夜福利片| 视频在线观看一区二区三区| 久久久国产一区二区| 99九九在线精品视频| 如何舔出高潮| www.av在线官网国产| 亚洲精品自拍成人| 91久久精品国产一区二区三区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲三级黄色毛片| 伊人亚洲综合成人网| 成人国产av品久久久| 99热6这里只有精品| 精品人妻一区二区三区麻豆| 大陆偷拍与自拍| 国产精品成人在线| √禁漫天堂资源中文www| 99久久精品国产国产毛片| 久久久久久久国产电影| 久久久久久久久久久免费av| 69精品国产乱码久久久| 国产成人免费无遮挡视频| 久久精品久久久久久久性| 人妻 亚洲 视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 色吧在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| av黄色大香蕉| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 又大又黄又爽视频免费| 热re99久久国产66热| 美女视频免费永久观看网站| av有码第一页| www.色视频.com| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲精品456在线播放app| 97超碰精品成人国产| 伊人亚洲综合成人网| 大片电影免费在线观看免费| 九色亚洲精品在线播放| 国产精品人妻久久久久久| a级毛片在线看网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99九九在线精品视频| 国产深夜福利视频在线观看| 熟女电影av网| 久久久国产一区二区| 日韩亚洲欧美综合| 一级毛片aaaaaa免费看小| 日本-黄色视频高清免费观看| 色婷婷av一区二区三区视频| av不卡在线播放| 丝袜喷水一区| 母亲3免费完整高清在线观看 | 亚洲av日韩在线播放| 精品一区二区免费观看| √禁漫天堂资源中文www| 人妻人人澡人人爽人人| 国产一级毛片在线| 人妻 亚洲 视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲精品成人av观看孕妇| 赤兔流量卡办理| a级毛片在线看网站| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲精品成人av观看孕妇| 在线播放无遮挡| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲情色 制服丝袜| 热re99久久精品国产66热6| 99国产精品免费福利视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产精品久久久久久精品古装| 午夜福利,免费看| 91国产中文字幕| 黄片播放在线免费| 国产深夜福利视频在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲精品第二区| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 美女内射精品一级片tv| 日韩电影二区| 日本av免费视频播放| 久久青草综合色| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产免费现黄频在线看| 日韩大片免费观看网站| 麻豆乱淫一区二区| 久久久国产精品麻豆| 哪个播放器可以免费观看大片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 啦啦啦啦在线视频资源| 成年人免费黄色播放视频| 日韩精品有码人妻一区| 老司机亚洲免费影院| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 黄色毛片三级朝国网站| 日本欧美视频一区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久午夜福利片| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 日韩大片免费观看网站| 国产av国产精品国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品少妇内射三级| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产高清有码在线观看视频| 成人无遮挡网站| av线在线观看网站| av有码第一页| 街头女战士在线观看网站| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 99国产精品免费福利视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 色视频在线一区二区三区| 日韩 亚洲 欧美在线| 18禁动态无遮挡网站| 岛国毛片在线播放| 免费观看av网站的网址| 国产成人91sexporn| 久久精品久久精品一区二区三区| 青春草国产在线视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 九九在线视频观看精品| 久久久久久伊人网av| 18禁在线播放成人免费| 一级毛片我不卡| 久久久久久人妻| 日本黄色日本黄色录像| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 好男人视频免费观看在线| 欧美 日韩 精品 国产| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产成人精品久久久久久| 亚洲伊人久久精品综合| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久精品国产亚洲网站| 国产午夜精品一二区理论片| 国产成人精品久久久久久| 成人国语在线视频| 一级毛片我不卡| 伊人久久国产一区二区| 久久亚洲国产成人精品v| 3wmmmm亚洲av在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 精品酒店卫生间| 亚州av有码| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲人成77777在线视频| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品熟女少妇av免费看| av天堂久久9| 亚洲国产成人一精品久久久| 交换朋友夫妻互换小说| 美女福利国产在线| 热99久久久久精品小说推荐| 色吧在线观看| 91精品国产九色| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 色哟哟·www| 亚洲性久久影院| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 岛国毛片在线播放| 少妇的逼好多水| 国产精品久久久久久久久免| 久久久亚洲精品成人影院| xxxhd国产人妻xxx| 丝袜喷水一区| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲国产精品国产精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产精品三级大全| 成年人午夜在线观看视频| 一个人免费看片子| 久久久久国产网址| 久久久久精品久久久久真实原创| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品久久久久久精品电影小说| 精品一区二区三卡| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产亚洲欧美精品永久| 久久ye,这里只有精品| 99九九在线精品视频| 黄色毛片三级朝国网站| 51国产日韩欧美| 日本欧美视频一区| 欧美日韩综合久久久久久| 极品人妻少妇av视频| 国产免费视频播放在线视频| 999精品在线视频| 熟女av电影| 欧美日韩成人在线一区二区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 另类精品久久| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日韩中字成人| 美女内射精品一级片tv| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 满18在线观看网站| 九色成人免费人妻av| 精品人妻熟女av久视频| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 一级爰片在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 成人国产麻豆网| 校园人妻丝袜中文字幕| 成人二区视频| 五月开心婷婷网| 日韩制服骚丝袜av| 免费观看的影片在线观看| 人妻 亚洲 视频| 成人手机av| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲美女视频黄频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲精品av麻豆狂野| 两个人免费观看高清视频| 精品国产一区二区久久| 妹子高潮喷水视频| 美女大奶头黄色视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 赤兔流量卡办理| 色吧在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 蜜臀久久99精品久久宅男| 美女内射精品一级片tv| 国产在线免费精品| 午夜免费鲁丝| 亚洲国产精品999| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲av不卡在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 久久影院123| 久久久久久久亚洲中文字幕| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日韩一区二区三区影片| 日韩一本色道免费dvd| 午夜福利影视在线免费观看| 五月开心婷婷网| 中文字幕最新亚洲高清| 秋霞伦理黄片| 久久久国产一区二区| 亚洲国产精品国产精品| 视频区图区小说| 秋霞在线观看毛片| 亚洲欧美精品自产自拍| 大片免费播放器 马上看| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲av福利一区| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲av免费高清在线观看| 成人免费观看视频高清| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 少妇的逼水好多| 国产一区亚洲一区在线观看| 中文字幕制服av| 亚洲av国产av综合av卡| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产一区二区三区综合在线观看 | 人妻系列 视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 99九九在线精品视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 伦理电影免费视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品国产一区二区久久| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 九色亚洲精品在线播放| 国产永久视频网站| 国产 精品1| 永久网站在线| 免费日韩欧美在线观看| 免费观看av网站的网址| 我要看黄色一级片免费的| 精品酒店卫生间| 色视频在线一区二区三区| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美另类一区| 亚洲第一av免费看| 成人国产av品久久久| 搡女人真爽免费视频火全软件| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日本-黄色视频高清免费观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 不卡视频在线观看欧美| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲欧美成人精品一区二区| 在线观看国产h片| 精品一品国产午夜福利视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 性色avwww在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲av综合色区一区| 午夜日本视频在线| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 午夜日本视频在线| 久久人人爽人人片av| 欧美精品一区二区大全| 老司机影院成人| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产男女内射视频| 春色校园在线视频观看| 午夜免费鲁丝| 老熟女久久久| 欧美精品一区二区大全| 久久韩国三级中文字幕| 免费人成在线观看视频色| 成人毛片a级毛片在线播放| 一区二区三区四区激情视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 国产高清不卡午夜福利| 日韩大片免费观看网站| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产av精品麻豆| 中文字幕最新亚洲高清| 十八禁高潮呻吟视频| 男女边摸边吃奶| 毛片一级片免费看久久久久| 久久久精品免费免费高清| 久久久久精品久久久久真实原创| 最黄视频免费看| 久久青草综合色| 成人综合一区亚洲| 观看av在线不卡| 国产片特级美女逼逼视频| videosex国产| 在线观看国产h片| 夜夜爽夜夜爽视频| 日韩中字成人| 99热6这里只有精品| 国产熟女欧美一区二区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 男女无遮挡免费网站观看| 午夜av观看不卡| 亚洲国产色片| 伦理电影大哥的女人| av在线观看视频网站免费| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 美女中出高潮动态图| 亚洲精品亚洲一区二区| 美女福利国产在线| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 好男人视频免费观看在线| h视频一区二区三区| 欧美日韩精品成人综合77777| 欧美精品亚洲一区二区| 久久鲁丝午夜福利片| 制服人妻中文乱码| 国产日韩欧美在线精品| 精品久久久久久久久亚洲| 午夜激情av网站| 国产熟女欧美一区二区| 欧美性感艳星| 在线观看免费视频网站a站| 99热网站在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 免费观看在线日韩| xxxhd国产人妻xxx| 两个人免费观看高清视频| 欧美国产精品一级二级三级| a级片在线免费高清观看视频| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美人与善性xxx| 久久青草综合色| av有码第一页| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲四区av| 满18在线观看网站| 秋霞在线观看毛片| 国产熟女午夜一区二区三区 | 国产成人精品婷婷| 国产又色又爽无遮挡免| 人人澡人人妻人| 免费看光身美女| 免费观看无遮挡的男女| 国产熟女欧美一区二区| 欧美日韩av久久| 亚洲av国产av综合av卡| 香蕉精品网在线| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品亚洲成国产av| 国产男女内射视频| 人妻一区二区av| 黄片播放在线免费| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 能在线免费看毛片的网站| 久久人妻熟女aⅴ| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产成人aa在线观看| 亚洲精品视频女| 另类精品久久| 极品人妻少妇av视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 2018国产大陆天天弄谢| 人妻一区二区av| 国产成人免费无遮挡视频| 最近中文字幕2019免费版| 一本大道久久a久久精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久久久国产精品人妻一区二区| 黄片无遮挡物在线观看| 高清毛片免费看| 97超视频在线观看视频| 另类亚洲欧美激情| 免费观看性生交大片5| 久久久国产精品麻豆| 亚洲欧美清纯卡通| 22中文网久久字幕| 丝袜在线中文字幕| 国产一区二区在线观看av| 国产色爽女视频免费观看| 午夜久久久在线观看| 午夜福利,免费看| 午夜福利视频精品| 制服丝袜香蕉在线| 国产精品一二三区在线看| 日本色播在线视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲国产日韩一区二区| 免费观看的影片在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 啦啦啦啦在线视频资源| 美女国产视频在线观看| 中文字幕久久专区| 欧美性感艳星| 曰老女人黄片| 插逼视频在线观看| 欧美日韩av久久| 国产精品成人在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚州av有码| 热99久久久久精品小说推荐| 国产高清有码在线观看视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 下体分泌物呈黄色| 国产精品一国产av| av黄色大香蕉| 欧美国产精品一级二级三级| 不卡视频在线观看欧美| av电影中文网址| 男女啪啪激烈高潮av片| 晚上一个人看的免费电影| www.色视频.com| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 夜夜骑夜夜射夜夜干| 日韩一本色道免费dvd| 欧美 日韩 精品 国产| 色吧在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 一区二区三区四区激情视频| 欧美三级亚洲精品| 三级国产精品片| 日本wwww免费看| 久久婷婷青草| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日韩中字成人| 亚洲第一av免费看| 9色porny在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日本av免费视频播放| 91精品国产九色| 免费观看a级毛片全部| 九色亚洲精品在线播放| 午夜精品国产一区二区电影| av在线观看视频网站免费| 午夜老司机福利剧场| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲精品av麻豆狂野| 十八禁网站网址无遮挡| 9色porny在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产免费一级a男人的天堂| 日韩伦理黄色片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲四区av| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 一本久久精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 在现免费观看毛片| 美女大奶头黄色视频| 久久99热6这里只有精品| av免费观看日本| 亚洲av不卡在线观看| 又大又黄又爽视频免费| 久久精品国产亚洲av天美| 午夜91福利影院| 人体艺术视频欧美日本| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲第一区二区三区不卡| 色婷婷久久久亚洲欧美| 美女大奶头黄色视频| 少妇 在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片 | 欧美激情极品国产一区二区三区 | 三上悠亚av全集在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产欧美亚洲国产| 美女国产高潮福利片在线看| 久久精品国产自在天天线| 一级毛片aaaaaa免费看小| 中文字幕av电影在线播放| 交换朋友夫妻互换小说| 18禁观看日本| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产精品一区二区在线观看99| a 毛片基地| 少妇人妻 视频| 国产午夜精品一二区理论片| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 91成人精品电影| 天堂8中文在线网| 亚洲第一区二区三区不卡| 美女视频免费永久观看网站| 2018国产大陆天天弄谢| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲综合色惰| 国产成人一区二区在线| 国产精品熟女久久久久浪| 最黄视频免费看| 人妻 亚洲 视频| 午夜91福利影院| 街头女战士在线观看网站| 天天影视国产精品| 免费观看无遮挡的男女| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 免费高清在线观看日韩| 在线观看www视频免费| 国产男人的电影天堂91| 大香蕉久久网| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久久久久久大av| 久久av网站| 在线 av 中文字幕| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 午夜免费男女啪啪视频观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 精品久久久久久久久亚洲| 午夜视频国产福利| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 看免费成人av毛片| 黄色视频在线播放观看不卡| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲久久久国产精品| 国产老妇伦熟女老妇高清| 五月伊人婷婷丁香| av专区在线播放| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产精品偷伦视频观看了| 中文字幕久久专区| 久久午夜福利片| 国产一区二区三区av在线| 日韩一区二区视频免费看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 一区在线观看完整版| 午夜视频国产福利| 高清欧美精品videossex| 日本午夜av视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 一区二区三区免费毛片| av播播在线观看一区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产黄频视频在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 毛片一级片免费看久久久久| 黄片无遮挡物在线观看| 99久久精品一区二区三区| 春色校园在线视频观看|