基于高通量測(cè)序技術(shù)分析新疆不同地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬微生物群落多樣性

武亞婷，杜木英，何歡歡，闞建全，程方方，殷娜，劉維兵，丁承焱，尹小慶，武運(yùn)*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊,830052)2(新疆果品精深加工與貯運(yùn)保鮮工程技術(shù)研究中心，新疆 烏魯木齊,830052)3(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 4(中匈食品科學(xué)聯(lián)合研究中心，重慶，400715)

自然發(fā)酵辣椒醬營(yíng)養(yǎng)豐富，色澤鮮艷，其風(fēng)味不僅取決于辣椒原料和生產(chǎn)工藝，還與發(fā)酵過(guò)程中的微生物代謝密切相關(guān)[1]。不同的微生物會(huì)利用辣椒原料進(jìn)行發(fā)酵，可能產(chǎn)生不同的有機(jī)酸和氨基酸等風(fēng)味物質(zhì)，從而對(duì)辣椒醬的品質(zhì)造成一定的影響[2]。新疆地區(qū)的辣椒醬多以農(nóng)戶家庭自制為主，眾所周知，農(nóng)家自制辣椒醬的環(huán)境相對(duì)開(kāi)放，基質(zhì)中存在大量微生物，可能蘊(yùn)藏一定數(shù)量對(duì)辣椒醬品質(zhì)形成有積極意義或有潛在益生特性的菌株，也可能含有一些致病菌及條件致病菌[3-4]。傳統(tǒng)微生物檢測(cè)主要通過(guò)觀察形態(tài)、革蘭氏染色和生化反應(yīng)等進(jìn)行比對(duì)分析，雖然操作簡(jiǎn)單且可直接得到結(jié)果，但不適用于菌群大批量分析鑒定[5]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和測(cè)序成本的降低，宏基因組測(cè)序、擴(kuò)增子測(cè)序和16S rDNA測(cè)序等手段越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注[6]。如沈馨等[7]利用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)研究了辣椒醬核心細(xì)菌類(lèi)群，發(fā)現(xiàn)湖北當(dāng)陽(yáng)地區(qū)辣椒醬中的優(yōu)勢(shì)菌是芽孢桿菌(Bacillus)和葡萄球菌(Staphylococcus)；趙玲艷等[8]研究了自然發(fā)酵辣椒微生物多樣性及其宏轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵線椒中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Weissella、Lactobacillus、Aureimonas和Rhizobium，優(yōu)勢(shì)真菌為Hanseniaspora、Debaryomyces、Rhodotorula和Trichosporon等；鐘燕青[9]研究湖南地區(qū)自然發(fā)酵剁辣椒，發(fā)現(xiàn)主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是植物乳桿菌(Lacto-bacillusplantarum)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)和短乳桿菌(Lactobacillusbreris)；韓俊燕等[10]研究發(fā)酵辣椒多樣性，發(fā)現(xiàn)剁辣椒中的優(yōu)勢(shì)菌是魏斯氏菌、明串珠菌和乳桿菌。

新疆地域遼闊，辣椒產(chǎn)業(yè)是當(dāng)?shù)丶t色產(chǎn)業(yè)，辣椒適栽區(qū)具有復(fù)雜多樣的生態(tài)地理環(huán)境，蘊(yùn)含著豐富的微生物菌株資源[11]。但遺憾的是目前關(guān)于新疆地區(qū)辣椒醬細(xì)菌微生物多樣性的研究一直未得到應(yīng)有的重視，其多樣性研究在新疆尚屬空白。沙漠等[12]圍繞新疆辣椒醬在加工中的問(wèn)題，篩選了適用于發(fā)酵辣椒制品發(fā)酵性能穩(wěn)定的乳酸菌；但是未對(duì)辣椒醬發(fā)酵過(guò)程中的真菌進(jìn)行深入研究，尤其是酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中的作用。

本研究利用MiSeq技術(shù)對(duì)新疆哈密(A)、伊犁(B)、昌吉(C)、阿克蘇(D)和烏魯木齊(E)地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬中的微生物組成進(jìn)行解析，以期揭示自然發(fā)酵辣椒醬中細(xì)菌和真菌的多樣性，為發(fā)酵辣椒的安全生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)，同時(shí)為適合辣椒醬發(fā)酵微生物的篩選提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

利用無(wú)菌袋，對(duì)5個(gè)地區(qū)的自然發(fā)酵辣椒醬進(jìn)行取樣，每個(gè)地區(qū)取5份樣品,具體如表1所示。

表1 試驗(yàn)樣品Table 1 Experimental samples

1.2 試劑與儀器

瓊脂糖，西班牙Biowest Agarose公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，AXYGEN公司；Gold View I核酸染料，北京中生瑞泰科技有限公司；所有無(wú)機(jī)、有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

5430R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；My Cycler型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀，美國(guó)Bio-rad公司； Bio-Best 200E 型凝膠成像分析系統(tǒng)，賽多利斯公司； Miseq測(cè)序儀，Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增

稱(chēng)取10 g辣椒醬樣品，DNA提取嚴(yán)格按照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，細(xì)菌16S rDNA V3-V4擴(kuò)增通用引物：341F(5′-CCTACGGGRSGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′)；真菌I T S 2區(qū)域擴(kuò)增通用引物：2045F(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和2930R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應(yīng)體系為：2×KAPA Library Amplification ReadyMix 15 μL，引物(10 μM)F和R各為1 μL，模板DNA為50 ng，最后加ddH2O 至30 μL。細(xì)菌PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性180 s；95 ℃變性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，反應(yīng)35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸48 s，-20 ℃保存。真菌PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性180 s；98 ℃變性20 s，58℃退火15 s，72℃延伸20 s，執(zhí)行35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃維持300 s，-20 ℃保存。利用Thermo NanoDrop 2 000紫外微量分光光度計(jì)和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，而后根據(jù)AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒說(shuō)明書(shū)切膠回收PCR產(chǎn)物。

1.3.2 Illumina MiSeq HiSeq PE250 測(cè)序

文庫(kù)質(zhì)檢合格后，使用Qubit 2.0進(jìn)行文庫(kù)定量，并根據(jù)每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。采用MiSeq平臺(tái)PE250策略進(jìn)行雙末端測(cè)序，通過(guò)重疊關(guān)系進(jìn)行拼接，獲得高變區(qū)的長(zhǎng)reads。

1.4 數(shù)據(jù)處理

16S序列長(zhǎng)為220～500 bp，保證每條reads含N數(shù)不超過(guò)3個(gè)，且平均質(zhì)量值不低于20。對(duì)序列完全相同的Clean Reads，過(guò)濾掉其中的Singletons，根據(jù)其豐度大小進(jìn)行排序。使用UPARSE(http://drive5.com/uparse/)將97%相似度進(jìn)行OTU聚類(lèi)，利用Userach 7.0鑒定并移除嵌合體序列。使用RDP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rdp.cme.msu.edu/)，將OTU置信度閾值設(shè)置為0.8，利用RDPC lassifer(http://rdp.cme.msu.edu/)將具有代表性的序列進(jìn)行物種注釋。OTU proflingtable和alpha多樣性分析通過(guò)Qiime的python腳本實(shí)現(xiàn)[13-14]。使用R語(yǔ)言和Network工具分析和作圖；使用主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis，PCoA)的方法展示各個(gè)樣品間的差異大?。皇褂脝我蛩胤讲罘治霰容^樣本間是否存在顯著性差異，采用fdr方法對(duì)p值進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU分析

由圖1-a看出，5個(gè)地區(qū)的25個(gè)樣品共含有1 562個(gè)細(xì)菌OTU，5個(gè)地區(qū)共有的細(xì)菌種類(lèi)有440個(gè)，在不同組樣品間有顯著差異的OTU(P<0.05)共57個(gè)。其中D地區(qū)OTU數(shù)量最多，有1 182個(gè)，A地區(qū)最少，有724個(gè)；B、C和E 3個(gè)地區(qū)OUT差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明細(xì)菌種類(lèi)比較相似。由圖1-b看出，25個(gè)樣品中含有396個(gè)真菌OTU，5個(gè)地區(qū)共有的真菌種類(lèi)有88個(gè)，在不同組樣品間有顯著差異的OTU(P<0.05)共14個(gè)。其中A地區(qū)OTU數(shù)量最多，有249個(gè);C地區(qū)最少，有198個(gè)；B、D和E 3個(gè)地區(qū)OTU差異不顯著(P>0.05)，真核微生物種類(lèi)相似度較高。綜合分析，在新疆自然發(fā)酵辣椒醬中，不同地區(qū)真菌種類(lèi)明顯少于細(xì)菌種類(lèi)，伊犁地區(qū)和烏魯木齊地區(qū)微生物多樣性比較相似。

a-細(xì)菌;b-真菌圖1 微生物群落維恩圖Fig.1 Venn diagram of microbial community

2.2 α-多樣性分析

Coverage指數(shù)代表測(cè)序?qū)ξ锓N的覆蓋度，Shannon指數(shù)能夠?qū)悠分形⑸锒鄻有赃M(jìn)行衡量，Shannon數(shù)值越大說(shuō)明微生物的多樣性越高。Chao指數(shù)可以估算樣品中物種的數(shù)目。

表2 α-多樣性指數(shù)Table 2 α-diversity index of samples

由表2可知，辣椒醬中微生物Coverage指數(shù)都大于0.99，說(shuō)明樣本測(cè)序結(jié)果可以反應(yīng)樣品的真實(shí)情況。根據(jù)Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)可知，不同地區(qū)辣椒醬樣品中細(xì)菌平均Chao指數(shù)差異較明顯。E地區(qū)的平均Chao指數(shù)最大，為124.87；D地區(qū)的平均Chao指數(shù)最小，為83.26，其中Y78和Y44樣品的Chao指數(shù)較大，屬于異常值；B地區(qū)樣品的平均細(xì)菌Shannon指數(shù)為1.88，顯著高于其他地區(qū)。綜上說(shuō)明，烏魯木齊地區(qū)的細(xì)菌物種數(shù)目多于其他地區(qū)，伊犁地區(qū)細(xì)菌群落多樣性優(yōu)于其他地區(qū)。

就真菌而言，D地區(qū)的平均Chao指數(shù)和平均Shannon指數(shù)最大，分別為669.904和4.53，說(shuō)明阿克蘇地區(qū)真菌群落豐度和多樣性都高于其他地區(qū)。從α-多樣性指數(shù)可以得出，辣椒醬樣品中細(xì)菌物種豐度顯著高于真菌，說(shuō)明在辣椒自然發(fā)酵過(guò)程中主要優(yōu)勢(shì)菌群是細(xì)菌，由于自然發(fā)酵的辣椒醬多在室溫厭氧環(huán)境中進(jìn)行，該環(huán)境更有利于細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.3 新疆不同地區(qū)辣椒醬樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

從微生物分類(lèi)門(mén)的水平上來(lái)看，A、B、C、D、E地區(qū)的樣品中分別含有15、16、16、17、16個(gè)門(mén)水平的細(xì)菌，主要包括厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、藍(lán)藻菌門(mén)(Cyanobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、螺旋體門(mén)(Spirochaetes)和異常球菌-棲熱菌門(mén)(Deinococcus-Thermus)等。

由圖2可知，在門(mén)水平下，不同地區(qū)辣椒醬樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相同，差異較大的是相對(duì)豐度。厚壁菌門(mén)是5個(gè)地區(qū)辣椒醬樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，E地區(qū)樣品的平均豐度最大，為57.93%；D地區(qū)樣品豐度最小，為37.86%；A、B和C地區(qū)的豐度分別為48.73%、43.21%和47.64%。藍(lán)藻菌門(mén)是5個(gè)地區(qū)樣品中相對(duì)豐度較大的細(xì)菌，平均豐度達(dá)到41.46%；在B、C、D和E地區(qū)中的平均相對(duì)豐度分別為26.39%、25.84%、27.44%和22.39%。厚壁菌門(mén)和藍(lán)藻菌門(mén)豐度之和均大于60%，這可能是由于厚壁菌門(mén)中的乳桿菌和乳球菌大多數(shù)為厭氧細(xì)菌，能夠產(chǎn)酸且在強(qiáng)酸環(huán)境下生長(zhǎng)。藍(lán)藻菌門(mén)可能來(lái)自原料辣椒中的葉綠體。從各樣品在門(mén)水平的分類(lèi)情況來(lái)看，5個(gè)地區(qū)樣品中都出現(xiàn)了大量的藍(lán)藻菌門(mén)，但在接下來(lái)的分類(lèi)水平中沒(méi)有具體分類(lèi)。據(jù)報(bào)道線粒體、葉綠體分別起源于原始的好氧細(xì)菌和藍(lán)藻類(lèi)原核細(xì)胞，它們長(zhǎng)期與宿主進(jìn)行共生而逐漸演化為細(xì)胞器[15]。因?yàn)槔苯返娜~綠體和線粒體DNA與原核生物的DNA具有同源性，故推測(cè)藍(lán)藻菌門(mén)可能是來(lái)自辣椒原料中的葉綠體和線粒體。

圖2 不同地區(qū)辣椒醬樣品中門(mén)水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.2 Distribution of bacterial communities’ structure inchili sauce samples from different areas at phylum level

根據(jù)物種分類(lèi)結(jié)果，由于樣品中所檢測(cè)出的微生物種類(lèi)繁多，其中許多在物種中含量相對(duì)較少，因此篩選出優(yōu)勢(shì)物種，分別對(duì)豐度前20的細(xì)菌和真菌進(jìn)行物種分類(lèi)統(tǒng)計(jì)。由圖3可知，在屬水平下，不同地區(qū)辣椒醬樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相同，差異較大的是相對(duì)豐度。A、B、C和E地區(qū)樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是鏈形植物屬(Streptophyta)和乳桿菌屬(Lactobacillus)，其中A地區(qū)兩者豐度之和最大，為62.97%，B地區(qū)兩者豐度之和最小，為46.09%；D地區(qū)樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是鏈形植物和腸球菌屬(Enterococcus)，豐度之和為34.25%。在屬水平下，鏈形植物、乳桿菌屬和明膜串珠菌屬是新疆地區(qū)辣椒醬中的優(yōu)勢(shì)菌株。存在大量鏈形植物屬是由于采集的樣品多為秋季農(nóng)家自制的辣椒醬，在大氣顆粒物中大量存在[16]。乳桿菌屬和明膜串珠菌屬均隸屬乳酸菌，辣椒發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌利用糖類(lèi)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，同時(shí)產(chǎn)生醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)等多種風(fēng)味物質(zhì)，各個(gè)地區(qū)間豐度的差異也致使不同地區(qū)辣椒醬風(fēng)味物質(zhì)各有千秋。腸球菌屬通常為非條件致病菌，部分為人體腸道內(nèi)正常微生物，能利用糖酵解和戊糖磷酸途徑對(duì)糖進(jìn)行降解，產(chǎn)生有機(jī)酸[17]。該屬細(xì)菌在不同地區(qū)樣品中豐度差異較大，其中在E地區(qū)中豐度最小，僅占2.43%，與樣品有機(jī)酸含量相對(duì)較低，酸味口感不突出的結(jié)果一致。

在A、B、C、D和E地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬樣品中分別存在 0.011%、0.017%、0023%、4.471%、0.021%的芽孢桿菌，分析原因可能與辣椒醬中食鹽含量不同有關(guān)，D地區(qū)辣椒醬樣品的食鹽含量較低，芽孢桿菌含量相對(duì)較高。值得關(guān)注的是，芽孢桿菌是自然發(fā)酵豆豉中的優(yōu)勢(shì)菌，該菌株的存在可能會(huì)賦予辣椒醬特殊的風(fēng)味[18]。

圖3 不同地區(qū)辣椒醬樣品中屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.3 Distribution of bacterial communities’ structure inchili sauce samples from different areas at genus level

2.4 新疆不同地區(qū)辣椒醬樣品間真菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

由圖4可知，在門(mén)水平下，從A、B、C、D和E地區(qū)中一共鑒定出子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、接合菌門(mén)(Zygomycota)和鞭毛菌亞門(mén)壺菌綱(MastigomycotinaChytridiomycota)4個(gè)真菌物種，優(yōu)勢(shì)真菌都是子囊菌門(mén)(Ascomycota)，其豐度分別為31.45%、29.15%、33.80%、36.89%和18.81%。說(shuō)明子囊菌門(mén)在辣椒醬發(fā)酵中起重要作用。擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度在5個(gè)地區(qū)之間的差異較明顯，A、C、E地區(qū)辣椒醬樣品中擔(dān)子菌門(mén)的含量顯著低于B、D 2個(gè)地區(qū)。值得注意的是，在E地區(qū)還檢測(cè)到鞭毛菌亞門(mén)壺菌綱，有研究發(fā)現(xiàn)隸屬鞭毛菌亞門(mén)壺菌綱的馬鈴薯癌腫病菌是一種專(zhuān)性寄生的低等真菌，目前尚不能人工培養(yǎng)[19]；發(fā)現(xiàn)5個(gè)地區(qū)真菌的優(yōu)勢(shì)菌群差異較大，未知酵母的相對(duì)豐度都超過(guò)60%，E地區(qū)樣品中未知酵母高達(dá)80.55%，說(shuō)明新疆不同地區(qū)辣椒醬中真菌多樣性有待進(jìn)一步挖掘和發(fā)現(xiàn)。

圖4 不同地區(qū)辣椒醬樣品門(mén)水平真菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.4 Distribution of fungal communities’ structure inchili sauce samples from different areas atphylum level

由圖5可看出，在屬水平下，A地區(qū)樣品中優(yōu)勢(shì)真菌菌屬是畢赤酵母屬(Pichia)，相對(duì)豐度為9.31%，絲孢畢赤酵母屬是發(fā)酵飲料中常見(jiàn)的產(chǎn)香酵母，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品有增香作用[20]；B地區(qū)樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬是孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)，相對(duì)豐度為17.44%，Hanseniaspora主要存在于土壤、水果、腐敗的食品和飲料中，可發(fā)酵葡萄糖，生長(zhǎng)需要肌糖[21]；C地區(qū)樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬是威克漢姆酵母(Wickerhamomyces)，相對(duì)豐度為19.99%，據(jù)報(bào)道異常威克漢姆酵母菌株具有低產(chǎn)尿素、產(chǎn)風(fēng)味，耐酒精、耐酸的特征，是一種產(chǎn)香酵母，具有較高的產(chǎn) 3-甲基-1-丁醇能力，在發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生乙酸乙酯、2-苯基乙酸乙酯、乙酸異戊酯等對(duì)發(fā)酵辣椒風(fēng)味具有促進(jìn)作用的酯類(lèi)物質(zhì)，對(duì)發(fā)酵制品風(fēng)味有很好的貢獻(xiàn)作用[22]；D和E地區(qū)樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬是曲霉屬(Aspergillus)，相對(duì)豐度分別為27.17%和2.28%，LV等[23]從10份紅曲米酒酒曲中分離鑒定米曲霉和黃曲霉很強(qiáng)的α-淀粉酶或糖化酶活性，這說(shuō)明曲霉屬在米酒發(fā)酵過(guò)程中能夠有效地分解淀粉，增加小分子糖的含量，因而使米酒含糖量升高，導(dǎo)致口感偏甜。這與D、E 2地區(qū)辣椒醬樣品口味偏甜，酸味不突出結(jié)果一致。

本研究采集的樣品為發(fā)酵中后期的辣椒醬，由于酸度的增加，真菌的種類(lèi)和相對(duì)豐度都大大降低。A、C地區(qū)中包含德巴利(氏)酵母屬(Debaryomyces)，其豐度分別為6.60%、1.16%。B、C、D和E地區(qū)中都含有假絲酵母(Candida)，豐度分別為1.44%、2.98%、1.85%和0.58%。B、D地區(qū)中含有未知傘菌屬(Agaricomycetes_unidentified_1)，豐度分別為8.07%、16.29%。D地區(qū)中含有豐度較高的毛霉菌屬(Mucor)和青霉屬(Penicillium)，豐度分別為1.25%和0.53%。張仁鳳等[24]指出霉菌可產(chǎn)生物胺，不同菌株產(chǎn)生物胺的能力各不相同,但該地區(qū)樣品中生物胺含量還需要通過(guò)進(jìn)一步驗(yàn)證說(shuō)明。A地區(qū)樣品中特有的菌種是孢圓酵母(Torulaspora)，豐度為3.98%。李華敏等[25]指出孢圓酵母能顯著提高櫻花酒中β-苯乙醇、丁酸乙酯、異戊酸乙酯等揮發(fā)性組分的含量，能夠增加發(fā)酵香氣。C地區(qū)特有的菌種是螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)，豐度為5.44%。據(jù)報(bào)道,粉紅螺旋聚孢霉(Clonostachysrosea)可以通過(guò)分泌堿性泛解酸內(nèi)酯水解酶,將毒素玉米赤霉烯酮轉(zhuǎn)化成無(wú)雌激素性質(zhì)的產(chǎn)物[26]。E地區(qū)特有的菌是鏈格孢屬(Alternaria)，其豐度為0.63%。鏈格孢屬是重要的植物病原真菌,種類(lèi)繁多,寄主廣泛,近年來(lái)其在葡萄上引起的病害引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注[27]。5個(gè)地區(qū)包含了絕大多數(shù)的未知真菌物種，相對(duì)豐度都超過(guò)60%， E地區(qū)的樣品中未知真菌物種高達(dá)80.62%，優(yōu)勢(shì)菌群比較少。發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)辣椒醬發(fā)酵過(guò)程中特有的真菌，其功能需要進(jìn)一步探索，以便于更好地為辣椒醬產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；同F(xiàn)代化服務(wù)。

圖5 不同地區(qū)辣椒醬樣品中屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.5 Distribution of fungal communities’ structure in chilisauce samples from different areas at genus level

2.5 不同地區(qū)樣品間物種組成分析

如圖6-a所示， PCoA分析可以直觀地將樣品間相似或差異程度體現(xiàn)在二維坐標(biāo)圖上，距離越近則表示越相似。統(tǒng)計(jì)分析的可信度用P表示，P小于0.05表示統(tǒng)計(jì)具有顯著性。使用秩和檢驗(yàn)的方法對(duì)不同分組之間進(jìn)行顯著性差異分析，以找出對(duì)組間劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的物種，對(duì)于不同組樣品細(xì)菌群落，有19個(gè)屬、7個(gè)科和3個(gè)目，存在顯著性差異(P<0.05)。R為0.116,介于(-1，1)之間且大于0，說(shuō)明組間差異顯著。PCoA1和PCoA2分別解釋了不同地區(qū)樣品中細(xì)菌群落 39.54%和 33.96%的信息，2個(gè)主成分之和大于70%，表明2個(gè)成分較好地代表了樣品中的細(xì)菌群落信息。不同地區(qū)可明顯地劃分為2組，C、E和A、B、D，E地區(qū)樣品中2個(gè)點(diǎn)雖然偏離較遠(yuǎn)，但根據(jù)主成分一(39.54%) 可與其余樣品聚為一類(lèi)。發(fā)現(xiàn)A、B和D組樣品較為離散，各自獨(dú)立，說(shuō)明這3個(gè)地區(qū)樣品間細(xì)菌群落相似性不高；C、E組樣品間的距離較近，說(shuō)明這2個(gè)地區(qū)樣品間的細(xì)菌群落相似性高，該結(jié)果與這2個(gè)地區(qū)距離較近有密切關(guān)系。

a-細(xì)菌;b-真菌圖6 不同地區(qū)辣椒醬中微生物群落主成分分析圖Fig.6 The principal coordinate analysis of microbialcommunity structure in chili sauce samples from differentareas注：橫坐標(biāo)表示第1主坐標(biāo)，縱坐標(biāo)表示第2主坐標(biāo)，括號(hào)中的百分比則表示對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)率；圖中各點(diǎn)分別表示各個(gè)樣品，不同形狀代表樣品屬于不同的分組。盒形圖可以顯示最小值，第1個(gè)四分位數(shù)，中位數(shù)，第3個(gè)中位數(shù)和最大值，及由下到上的5條線，異常值以“o”標(biāo)出。

由圖6-b可知，對(duì)不同組微生物群落之間的物種進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，屬、科和目各4個(gè)，在不同組樣品真菌間有顯著差異(P<0.05)。R為0.193，介于(-1，1)之間且大于0，說(shuō)明組間差異顯著。PCoA1和PCoA2分別解釋了不同樣品真菌群落 54.54%和 17.69%的信息，2個(gè)主成分之和大于 70%，表明2個(gè)成分較好地代表了樣品中真菌群落信息。不同地區(qū)可明顯地劃分為2組，B、C、D和A、E，A地區(qū)樣品中的一點(diǎn)雖然偏離較遠(yuǎn)，但根據(jù)主成分一(54.54%) 可與其余樣品聚為一類(lèi)。分析2組發(fā)現(xiàn)B、C和D組樣品較為離散，各自獨(dú)立，說(shuō)明這3個(gè)地區(qū)樣品間真菌群落相似性不高；A和E組的樣品距離較近，說(shuō)明這2個(gè)地區(qū)樣品間真菌群落相似性高。

3 討論

本研究檢測(cè)辣椒醬樣品微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)A、B、C、D、E地區(qū)樣品中都含有腸球菌屬、葡萄球菌和梭菌，其累計(jì)平均含量分別為2.476%、10.778%、9.445%、25.366%、7.242%。隸屬于上述3個(gè)屬的部分細(xì)菌是條件致病菌，例如隸屬于腸桿菌屬的阪崎腸桿菌[28]是引起新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和菌血癥的主要微生物；葡萄球菌中的金黃色葡萄球菌[29]可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、心包炎和偽膜性腸炎；梭菌屬中的破傷風(fēng)菌[30]屬是人畜破傷風(fēng)的病原體，產(chǎn)氣莢膜梭菌是人類(lèi)氣性壞疽的主要病原體。綜上所述，農(nóng)戶家自制的辣椒醬樣品中可能存在一定質(zhì)量安全隱患，只是不同地區(qū)樣品間菌株含量存在差異。阿克蘇地區(qū)含量明顯高于其他地區(qū)，其中腸球菌屬的含量明顯高于其他地區(qū)，分析原因可能與其樣品發(fā)酵周期較長(zhǎng)有關(guān)，也可能和阿克蘇地區(qū)的原料、水、土壤和空氣有關(guān)。哈密、昌吉和烏魯木齊地區(qū)樣品中特有的真菌菌種分別是孢圓酵母、螺旋聚孢霉屬和鏈格孢屬，因此后續(xù)試驗(yàn)研究孢圓酵母與發(fā)酵香氣的關(guān)系具有重要意義。值得關(guān)注的是，鏈格孢屬是否對(duì)烏魯木齊地區(qū)辣椒生長(zhǎng)有影響，因而后續(xù)研究原料辣椒中的微生物多樣性以及新疆不同地區(qū)水、土壤和空氣的微生物多樣性，無(wú)論是對(duì)了解辣椒醬的微生物多樣性，還是減少食品安全隱患均具有積極的意義。

沈馨等[7]以湖北當(dāng)陽(yáng)地區(qū)辣椒醬為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)酸味是辣椒醬樣品間差異最大的滋味指標(biāo)，微生物構(gòu)成對(duì)辣椒醬滋味品質(zhì)的形成具有較大的影響。韓俊燕等[10]研究安徽省黃山、湖南省永川、山西省平遙、吉林省延邊地區(qū)的發(fā)酵辣椒制品，發(fā)現(xiàn)菌群豐度在不同樣品中差異較大。門(mén)水平上，主要為厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和藍(lán)藻菌門(mén)；屬水平上，主要微生物為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、乳球菌屬、片球菌屬和明串珠菌屬。尚雪嬌等[31]研究恩施市3種泡辣椒樣品，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為硬壁菌門(mén)(Fir-micutes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)；優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳酸桿菌屬(Lactobacil-lus)。對(duì)比全國(guó)其他地區(qū)辣椒醬微生物多樣性研究，本研究結(jié)果中微生物多樣性特征與其他學(xué)者研究結(jié)果大體相同，但微生物種類(lèi)及其數(shù)量上具有差異。發(fā)現(xiàn)新疆不同地區(qū)辣椒醬樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相同，差異較大的是相對(duì)豐度，發(fā)酵辣椒醬中細(xì)菌的構(gòu)成比單純的發(fā)酵辣椒更為復(fù)雜，菌群的種類(lèi)和數(shù)量也不盡相同，與武俊瑞[32]的研究結(jié)果一致。5個(gè)地區(qū)的辣椒醬樣品中微生物在數(shù)量、種類(lèi)等方面都具有一定的差異，分析其原因可能是：采樣地區(qū)的氣候、地理位置、光照時(shí)間、制作方法(如食鹽添加量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、使用容器等)、飲食習(xí)慣等客觀因素的不同引起發(fā)酵辣椒醬成分的不同，因此不同地區(qū)辣椒醬中的微生物多樣性具有一定的差異。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬樣品進(jìn)行分析，主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌門(mén)為厚壁菌門(mén)、藍(lán)藻菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)。厚壁菌門(mén)是5個(gè)地區(qū)辣椒醬樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，藍(lán)藻菌門(mén)是5個(gè)地區(qū)樣品中相對(duì)豐度較大的細(xì)菌。鏈形植物屬和乳桿菌屬是哈密、伊犁、昌吉和烏魯木齊地區(qū)樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；鏈形植物和腸球菌屬是阿克蘇地區(qū)樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。從5個(gè)地區(qū)中一共鑒定出 4個(gè)真菌物種，優(yōu)勢(shì)真菌都是子囊菌門(mén)。畢赤酵母屬、孢漢遜酵母屬、威克漢姆酵母、曲霉屬和Davidiella分別是A、B、C、D和E地區(qū)樣品中優(yōu)勢(shì)真菌。畢赤酵母屬、孢漢遜酵母屬和威克漢姆酵母是哈密、伊犁和昌吉地區(qū)樣品中優(yōu)勢(shì)真菌，曲霉屬是阿克蘇和烏魯木齊地區(qū)的優(yōu)勢(shì)真菌。孢圓酵母是哈密地區(qū)樣品中特有的菌種；粘帚霉屬是昌吉地區(qū)特有的菌種；鏈格孢屬是烏魯木齊地區(qū)特有的菌種。

本研究選擇新疆不同地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬為研究對(duì)象，獲得的微生物信息涵蓋所有微生物包括死亡的微生物，也包括取樣時(shí)樣品體系中的微生物和取樣過(guò)程中增加的微生物，但研究結(jié)果并不能區(qū)分時(shí)間段，具有一定局限性。細(xì)菌和真菌無(wú)法同時(shí)進(jìn)行定量，也不能將微生物與其他相關(guān)指標(biāo)建立聯(lián)系，未來(lái)研究中還需進(jìn)行宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。本試驗(yàn)中存在大量未知菌屬，可能是因?yàn)闇y(cè)序數(shù)據(jù)中包含著較多未知數(shù)量菌種，很難通過(guò)一段DNA序列來(lái)確定來(lái)源。雖然有一定的局限性，但是也能在一定程度上反映出5個(gè)地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬中微生物群落。本研究首次大量采集新疆不同地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬，利用高通量測(cè)序的方法研究了新疆不同地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，為后續(xù)建立新疆辣椒醬中微生物體系指標(biāo)提供了理論支持，同時(shí)為適合辣椒醬發(fā)酵微生物的篩選提供基礎(chǔ)。