甜葉菊創(chuàng)新性提取和分離純化方法的研究進(jìn)展

張濤俊 周瑩婷 何建敏 魏淵

( 1.江蘇華泰重工裝備有限公司，江蘇 丹陽 212300；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013 )

0 引言

甜葉菊(學(xué)名：Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsl.)是菊科、甜菊屬的多年生草本植物，原產(chǎn)于南美巴拉圭和巴西交界的高山山脈，當(dāng)?shù)厝藗兂⑻鹑~菊的葉子作為佐料加入到食物和飲料中。甜葉菊葉片提取物中的甜菊糖苷(Steviol Glycosides,SGs)是作為甜味劑的主要成分，其中口感最佳且含量最高的兩種糖苷是Rebaudioside-A(RA)和Steviolside(Ste)。甜菊糖苷制得的精品為白色粉末，具有低熱量和高甜度的優(yōu)點(diǎn)，是食品及藥品工業(yè)的原料之一。本篇綜述圍繞甜葉菊的創(chuàng)新性提取技術(shù)和純化方法展開描述并與傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，主要目的旨在增加對甜葉菊的了解，并概述目前最新出現(xiàn)的創(chuàng)新性研究進(jìn)展。

1 創(chuàng)新性提取技術(shù)

1.1 高速剪切勻漿技術(shù)和渦輪萃取法

高速剪切機(jī)的原理是在電機(jī)驅(qū)動下內(nèi)外切割器以相向方向高速旋轉(zhuǎn)，產(chǎn)生強(qiáng)大的高剪切力，快速的粉碎物料，同時使物料和提取溶劑激烈的碰撞，在超短時間內(nèi)完成提取過程。而后，為了進(jìn)一步升高提取效率降低能耗，研究人員開發(fā)出了渦輪增壓萃取技術(shù)。渦輪增壓提取的原理是將空氣壓縮至容器中，增大容器中壓力，并產(chǎn)生具有攪拌作用的氣流，充分分散溶劑以促進(jìn)物料的傳質(zhì)。結(jié)合高速剪切勻漿技術(shù)，更加短時高效的提取物料中的有效成分。Martins.P.M 對甜葉菊的渦輪萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化，研究了物料粒徑、提取溶劑和物料比等因素對甜菊糖苷SGs、RA 和Ste 得率的影響。最后確定的最佳萃取工藝為：乙醇濃度70%、物料粒徑780μm、物料比1:10、提取18min、溫度23℃、渦輪機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)20000r/min。同動態(tài)浸漬法對比，優(yōu)化后萃取工藝18min 的得率與動態(tài)浸漬法1h 的得率相當(dāng)[1]。表明，渦輪萃取法短時高效且低能耗，是一項(xiàng)很有應(yīng)用前景的提取方法。

1.2 加壓熱水提取法

為了避免和減少甜葉菊提取過程中有機(jī)溶劑的使用，更加環(huán)保和安全的生產(chǎn)甜菊糖苷SGs, á.Németh 開發(fā)了加壓熱水提取法，其優(yōu)點(diǎn)在于可以調(diào)節(jié)提取過程中的壓力，在高于溶劑沸點(diǎn)的溫度下萃取，高溫在增加甜菊糖苷SGs 溶解度的同時，不斷改變的壓力還可以增加溶劑穿過物料孔隙時的擴(kuò)散速度。而后，因?yàn)槿~片溶脹幾乎完全吸收了提取溶液水，傳統(tǒng)的離心過濾達(dá)不到分離要求，因此采用了壓榨法分離提取液。最后，選用噴霧干燥得到粗提取物。且對比未干燥的提取液，噴霧干燥后粉末穩(wěn)定性提高，且目標(biāo)產(chǎn)物甜菊糖苷SGs 的口感更好。此外Formigoni.M 等人還發(fā)現(xiàn)使用乙醇預(yù)處理后提取出的甜菊糖苷SGs 比未處理過直接提取的SGs 的雜質(zhì)含量更低，且純度更高。因此可以考慮在使用加壓熱水提取法前，預(yù)先用乙醇處理甜葉菊葉片，最后制得的目標(biāo)產(chǎn)物SGs 不僅純度高口感好，產(chǎn)率也會顯著提升。

1.3 微波輔助亞臨界水提取法

亞臨界水是將水加熱到沸點(diǎn)至臨界點(diǎn)100～374℃，系統(tǒng)壓力在2.6bar左右使其依舊保持液體狀。液態(tài)水的性質(zhì)發(fā)生改變，溶解溶質(zhì)的能力增強(qiáng)，擴(kuò)散速率提高，極性、粘度和表面張力下降。微波輔助的協(xié)同作用在于驟然系統(tǒng)溫度，達(dá)到產(chǎn)生亞臨界水的要求，且加強(qiáng)水分子穿透物料。而且，微波輔助亞臨界水提取在1min 內(nèi)的SGs 提取率與70%乙醇超聲45min 的提取率相當(dāng)。這表明它在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中具有很大的應(yīng)用前景。此外Rouhani 等人還開發(fā)了超聲輔助甘油萃取法，具有類似的協(xié)同增強(qiáng)原理，即超聲技術(shù)的熱效應(yīng)和空化效應(yīng)促進(jìn)甘油對植物細(xì)胞壁的滲透作用，提取過程綠色無污染，也很適用于食品行業(yè)的生產(chǎn)。

1.4 快速固-液動態(tài)萃取技術(shù)

快速固-液動態(tài)萃取技術(shù)是使用Naviglio 萃取器，采用循環(huán)加壓萃取法結(jié)合浸漬法的一種高效提取方法。Naviglio 萃取器原理是固體物料內(nèi)部和萃取液體之間存在負(fù)壓梯度，迫使固體物料中可溶性組分溶出。而循環(huán)加壓可以誘導(dǎo)固體物料表面形成新的擴(kuò)散通道，且變化的壓力可以驅(qū)動萃取劑在擴(kuò)散通道中往復(fù)運(yùn)動，增強(qiáng)溶質(zhì)和溶劑的相互作用。Gallo.Monica 通過實(shí)驗(yàn)對比其與80℃熱水浸漬法的得率，結(jié)果表明80℃熱水浸漬法下甜菊糖苷SGs 的提取率更高，但是在能耗方面，快速固-液動態(tài)萃取技術(shù)在室溫下即可進(jìn)行，因此耗能更低。且80℃熱水浸漬法的雜質(zhì)率更高，提取的SGs 的純度也低于前者。

2 分離與純化

2.1 鈣-二氧化硅微球

二氧化硅微球是多用于藥物控釋研究的載體材料，因其具有獨(dú)特的多孔外殼結(jié)構(gòu)，強(qiáng)負(fù)載性、較大比表面積和高滲透性的優(yōu)點(diǎn)，近年來也開始用于雜質(zhì)純化。Ca2+是提取過程中理想的除雜離子。而鈣-二氧化硅微球結(jié)合了二者的優(yōu)點(diǎn)，具有非常好的雜質(zhì)吸附能力。Meric.GamzeGunduz 等人采用溶膠-凝膠微膠囊化方法將Ca2+添加到二氧化硅微球里制備出可循環(huán)使用且高效吸附的鈣-二氧化硅微球，考察了在甜菊糖苷SGs提取過程中的影響，并比較了三次循環(huán)使用后的除雜效果，發(fā)現(xiàn)其不會損失SGs，在多次使用后還會依舊保持優(yōu)秀的除雜能力。反觀只能在低PH 環(huán)境下使用的海藻鈉珠，雖然除雜效率高但是甜菊糖苷SGs 的損失率也很高。實(shí)驗(yàn)還表明，鈣-二氧化硅微球的除雜率與使用有機(jī)溶劑除雜的效果相當(dāng)[2]，但考慮到環(huán)保和安全問題，在甜菊糖苷SGs 生產(chǎn)中優(yōu)先推薦使用鈣-二氧化硅微球。

2.2 超濾膜

使用膜分離法最大的困擾便是膜污染后，總是需要清洗膜表面或更換新膜才能繼續(xù)過濾，致使過濾的時間延長效率降低。而要使膜表面在保持無污垢狀態(tài)下持續(xù)過濾，就需要通過壓力調(diào)節(jié)滲透通量使其低于能產(chǎn)生污垢的臨界通量。Camilo 為了縮短過濾時間，使用高性能切向流以使過濾過程保持在可持續(xù)穩(wěn)定狀態(tài)，還可分散積累在膜表面的溶質(zhì)提高擴(kuò)散分布。且使用連續(xù)脫硝技術(shù)以快速高效的清洗污染后的膜表面。該分離方法為二次過濾，先用0.2μm 的微孔濾膜初濾甜葉菊水提液中的不溶性雜質(zhì)，再用15/3KDa 膜進(jìn)行二次超濾(3KDa 的膜除雜率略高于15KDa 但RA 和ste 的回收率略低，15KDa 膜上雜質(zhì)保留量相對更少易清洗，但是總體上二者區(qū)別不大，可以替換使用)。測試在過濾效率相同時，這種可持續(xù)通量下兩次膜分離法比單濃度法和連續(xù)重濾法過濾效率更高且耗時更短。此外，在Das.Ariji 研究中還發(fā)現(xiàn)膜孔增大，滲透通量不一定會增加。原因在于膜孔內(nèi)吸附的溶質(zhì)和雜質(zhì)也相應(yīng)增多，且膜上形成的動態(tài)濾餅層造成了嚴(yán)重的濃度差極化，導(dǎo)致滲透通量嚴(yán)重下降。此時，就只能通過加壓和增流來改善膜的滲透通量。同時為了提高防污性能且不增加過濾過程中甜菊糖苷SGs 的損失率，Roy.Anirban 使用二甲基乙酰胺DMAC 將親水的醋酸纖維素材料和疏水的聚丙烯腈材料混合制成聚合物共混膜，考慮到溶液的滲透性與膜親水性成正比，最佳混合比例為10:10(重量百分比)，并篩選出90KDa 的膜分子量最佳，SGs 的損失率最低且穩(wěn)態(tài)通量最高。

2.3 生物大分子絮凝劑

生物大分子絮凝劑是由微生物代謝產(chǎn)生并分泌至細(xì)胞外的具有絮凝和滲透作用的高分子物質(zhì)，包括糖蛋白、多糖、纖維素、蛋白質(zhì)和DNA 等。王菁莎等人在甜菊糖苷提取過程中，對比傳統(tǒng)鹽類絮凝劑FeCl3和KAl(SO4)2·12H2O 與生物大分子絮凝劑多糖螯合物的透光率和除雜率：鹽類絮凝劑都對目標(biāo)產(chǎn)物不具有選擇性，除雜過程中會造成SGs 損失，而且二次吸附和Cl-等有色離子也會對透光率產(chǎn)生一定的影響；生物大分子絮凝劑多糖螯合物溶于水后，顯現(xiàn)出獨(dú)特的金屬離子-多齒體的空間結(jié)構(gòu)，可吸收提取液中的大分子雜質(zhì)而不影響SGs 的含量，絮凝機(jī)制尚不清晰，應(yīng)該與絮凝劑的結(jié)構(gòu)、帶電荷、構(gòu)象、離子鍵和氫鍵形成相關(guān)[3]。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，生物大分子絮凝劑的不僅用量最少，除雜效率最高，而且不會造成目標(biāo)產(chǎn)物SGs 的含量變化，是優(yōu)良高效的除雜劑。

2.4 吸附樹脂

2.4.1 非極性大孔樹脂與甜葉菊母糖液

甜葉菊商業(yè)用途很廣，在生產(chǎn)工業(yè)結(jié)晶出RA、ste 等主要甜菊糖苷SGs 后，余留的母糖液多是廉價(jià)出售或直接廢棄。而實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)母糖液中仍有60%的SGs 成分，但是因?yàn)楹s質(zhì)量高，苦味較重，因此考慮可以進(jìn)一步純化利用。Liu Yaxian 等人研究了以非極性大孔吸附樹脂NDR-1 進(jìn)一步純化母糖液的工藝，通過添加電解質(zhì)NaCl 和醇類精確的調(diào)節(jié)溶劑極性。發(fā)現(xiàn)10%～30%乙醇與雜質(zhì)類極性相溶所以解吸雜質(zhì)的能力最強(qiáng)，但解吸甜菊糖苷的效果不好。這是因?yàn)镾Gs 和雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同，因此在極性洗脫劑中的被解吸的臨界值不同。

2.4.2 季氨基改性吸附樹脂

工業(yè)上要得到純凈的甜菊糖苷SGs 提取流程非常繁瑣，其中除雜、脫鹽脫色和精除雜就要使用4 種以上的不同類型的樹脂，洗脫溶劑的用量非常大，操作過程也非常耗時耗力。Rongfu等人通過將季氨基引入到吸附樹脂中，成功合成了同時具吸附功能和脫色功能的高分子改性樹脂，可以將樹脂除雜、脫鹽脫色步驟壓縮至一步，減少了洗脫溶劑的用量，更加高效、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保。分析季氨基改性的原理，是通過加強(qiáng)SGs 與樹脂的疏水締合作用增強(qiáng)樹脂吸附能力，且季氨基暴露在水中的部分能給予樹脂離子交換能力用于脫鹽脫色。但是需注意的是隨著季氨基的引入量增大，改性后的樹脂脫色能力增強(qiáng)，但對SGs 的吸附能力會減弱。

3 結(jié)語

工業(yè)上生產(chǎn)甜菊糖苷時，可以使用一些現(xiàn)代工藝如高速剪切法、亞臨界水、超聲和微波輔助技術(shù)，結(jié)合渦輪機(jī)等高效生產(chǎn)設(shè)備，可以顯著的提升甜菊糖苷SGs 的提取效率，且對比傳統(tǒng)提取工藝也相對更加的綠色安全。此外，近年來生物大分子絮凝劑、高分子膜和二氧化硅微球等材料，也開始逐漸涉入雜質(zhì)純化鄰域，這也體現(xiàn)了各個研究鄰域的互通性。當(dāng)代科技水平在迅猛發(fā)展，我國又是糖消耗大國，需求促進(jìn)了科技創(chuàng)新，而且甜菊糖苷SGs 的提取和分離純化方面也存在巨大的發(fā)展空間，未來必定會有更優(yōu)更高效更環(huán)保的生產(chǎn)技術(shù)和提取手段。但是，目前工業(yè)生產(chǎn)也存在一大迫切需要解決的問題，即減少生產(chǎn)過程中提取溶劑的消耗，若能達(dá)到‘無溶劑提取’則會更大化經(jīng)濟(jì)價(jià)值，這也必然成為今后甜葉菊鄰域的研究重點(diǎn)。