常用失眠動(dòng)物模型及其睡眠結(jié)構(gòu)特征研究進(jìn)展

王洛萱，李勁草，張有志

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

國(guó)際睡眠障礙分類第三版將失眠癥定義為在睡眠時(shí)間充足，環(huán)境適宜的條件下發(fā)生入睡或睡眠維持困難，并導(dǎo)致日間功能障礙的神經(jīng)精神疾?。?］，以入睡困難、頻繁覺(jué)醒、早醒和非恢復(fù)性睡眠為主要癥狀。失眠癥是最常見(jiàn)的睡眠障礙，短期失眠發(fā)生率可達(dá)30%～50%，世界主要工業(yè)國(guó)中，慢性失眠患者至少占總?cè)丝诘?%～10%，有5%～7%的人曾經(jīng)或正在使用處方藥治療失眠［1］。針對(duì)我國(guó)一般人群的流行病學(xué)調(diào)查表明，15%受慢性失眠困擾［2］。失眠可增加糖尿病、冠心病、哮喘、肥胖癥、抑郁癥、焦慮癥和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）的患病風(fēng)險(xiǎn)［3］，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量，同時(shí)也給社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)，據(jù)估計(jì)在美國(guó)失眠癥每年造成20億～160億美元的直接經(jīng)濟(jì)損失［1］。

針對(duì)失眠癥的治療措施主要包括改善睡眠衛(wèi)生習(xí)慣、認(rèn)知-行為療法和藥物治療，以藥物治療最為便捷有效，但目前常用的鎮(zhèn)靜催眠藥物存在不同程度的副作用和用藥安全問(wèn)題［1］，失眠治療需要安全有效的新型鎮(zhèn)靜催眠藥物。對(duì)于失眠癥的神經(jīng)生物基礎(chǔ)研究和新型鎮(zhèn)靜催眠藥物的臨床前評(píng)價(jià)需以建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型為基礎(chǔ)，模式生物多選擇大鼠、小鼠等嚙齒類動(dòng)物。候選藥物的鎮(zhèn)靜催眠作用常以能延長(zhǎng)戊巴比妥鈉所致小鼠翻正反射消失時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)［4］，也可參考動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)情況進(jìn)行判斷，但仍需以腦電結(jié)合肌電分析作為評(píng)價(jià)睡眠時(shí)間和睡眠結(jié)構(gòu)的金標(biāo)準(zhǔn)。與人類相似，嚙齒類動(dòng)物的腦電圖形由α，β，θ和δ 4種特征性波形組成，其睡眠過(guò)程可根據(jù)腦電和肌電特征分為非快速眼動(dòng)（non-rapid eye movement，NREM）睡眠和快速眼動(dòng)（rapid eye movement，REM）睡眠2種時(shí)相。NREM睡眠腦電特征以δ波為主，期間睡眠深度持續(xù)增加、無(wú)肌電活動(dòng)，是睡眠產(chǎn)生恢復(fù)作用的主要時(shí)期；REM睡眠常伴有陣發(fā)性肌電活動(dòng)，腦電活動(dòng)以θ波為主，2種時(shí)相在睡眠過(guò)程中的時(shí)間分配和各頻率腦波所占比例也是評(píng)價(jià)睡眠水平的重要指標(biāo)。

本文對(duì)目前常用動(dòng)物失眠模型進(jìn)行梳理，突出不同造模方法對(duì)動(dòng)物睡眠結(jié)構(gòu)和腦電特征的影響，以期為失眠癥及鎮(zhèn)靜催眠藥物的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 應(yīng)激失眠模型

應(yīng)激使下丘腦-垂體-腎上腺軸功能亢進(jìn)，產(chǎn)生的生理喚醒狀態(tài)可抑制睡眠。應(yīng)激源包括條件性應(yīng)激源和非條件性應(yīng)激源（如限制活動(dòng)和輕度電擊），對(duì)睡眠的影響因其性質(zhì)、強(qiáng)度、作用時(shí)間和個(gè)體敏感性而異。一般而言，短暫溫和的應(yīng)激導(dǎo)致REM睡眠增加；而長(zhǎng)時(shí)間較強(qiáng)應(yīng)激則嚴(yán)重?cái)_亂睡眠節(jié)律，產(chǎn)生類似失眠的狀態(tài)。將大鼠暴露于應(yīng)激環(huán)境中，數(shù)小時(shí)后出現(xiàn)睡眠潛伏期延長(zhǎng)、睡眠時(shí)間縮短、頻繁覺(jué)醒和睡眠碎片化，與應(yīng)激所致失眠的臨床特征相似［5］。

1.1 心理應(yīng)激

心理應(yīng)激模型在多種疾病的研究中應(yīng)用廣泛，使用心理應(yīng)激造模方法在睡眠研究中構(gòu)建動(dòng)物失眠模型也多見(jiàn)報(bào)道，其中束縛應(yīng)激是研究和使用較多的一種。束縛過(guò)程中，應(yīng)激因素持續(xù)存在，睡眠基本被完全剝奪。大鼠或小鼠經(jīng)歷短時(shí)間束縛（1～2 h）恢復(fù)自由活動(dòng)后，可出現(xiàn)持續(xù)數(shù)小時(shí)的反跳性睡眠增加，表現(xiàn)為NREM睡眠中低頻腦波活動(dòng)增加和REM睡眠時(shí)間延長(zhǎng)［6］。長(zhǎng)時(shí)間慢性束縛應(yīng)激可使模型動(dòng)物睡眠時(shí)間減少，睡眠結(jié)構(gòu)改變，出現(xiàn)失眠樣表現(xiàn)。王智等［7］在研究中使用束縛管對(duì)大鼠進(jìn)行造模，連續(xù)14 d，每天束縛6 h，大鼠表現(xiàn)為總睡眠時(shí)間減少，淺睡占比增加，NREM和REM睡眠比例降低。

1.2 陌生睡眠環(huán)境

陌生睡眠環(huán)境可影響睡眠的時(shí)間和質(zhì)量，這一現(xiàn)象常出現(xiàn)在長(zhǎng)途旅行或倒班工作的人群中，可稱為“首夜效應(yīng)”或“第一晚效應(yīng)”，在早期的睡眠臨床研究中，也觀察到研究對(duì)象在陌生的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中睡眠受到影響［8］?；谶@一效應(yīng)，可構(gòu)建簡(jiǎn)單有效的動(dòng)物失眠模型，如在籠具中引入新物體、改變飼養(yǎng)房間環(huán)境或更換飼養(yǎng)籠具均可導(dǎo)致大鼠（或小鼠）立刻出現(xiàn)睡眠潛伏期延長(zhǎng)及NREM和REM睡眠同時(shí)減少［9］。劉正［4］采用更換籠具的方法建立“第一晚效應(yīng)”小鼠失眠模型，并對(duì)其睡眠特征進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，更換籠具后，小鼠覺(jué)醒時(shí)間顯著增加，睡眠時(shí)間減少，睡眠維持困難，碎片化程度增加，伴有NREM睡眠強(qiáng)度代償性增加。TANG等［10］的研究表明，除對(duì)睡眠和覺(jué)醒時(shí)間影響外，更換籠具和新物體引入同時(shí)改變了模型動(dòng)物的睡眠腦電特征，主要表現(xiàn)為NREM睡眠過(guò)程中慢波活動(dòng)增加。GAMBLE等［11］對(duì)上述方法進(jìn)行改良，將大鼠連續(xù)暴露于2組不同的陌生籠具中（分別由其他大鼠使用7 d），單次暴露時(shí)間3 h，該法能更有效地干擾模型大鼠睡眠，并導(dǎo)致記憶力受損。模型大鼠覺(jué)醒時(shí)間和睡眠潛伏期增加，NREM和REM睡眠時(shí)間減少，上述失眠表現(xiàn)在初次更換籠具后的3 h內(nèi)更為明顯。

1.3 創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙

PTSD是一種由于受到威脅性或?yàn)?zāi)難性心理創(chuàng)傷而延遲出現(xiàn)或持續(xù)存在的精神障礙，睡眠障礙（頻繁覺(jué)醒、噩夢(mèng)和NREM睡眠減少）是PTSD患者主要癥狀之一［12］。許多用于PTSD研究的動(dòng)物模型同樣可作為失眠模型。此類模型多采用條件性恐懼法建立，將負(fù)性刺激（如足底電擊）與中性提示（如聲音、光照或特定物體）或特定環(huán)境（如實(shí)驗(yàn)房間）進(jìn)行關(guān)聯(lián)。造模成功后，條件性恐懼提示即可誘發(fā)動(dòng)物的恐懼和焦慮樣行為［13］。SHARMA等［12］使用天敵氣味作為負(fù)性刺激，特定籠具作為提示環(huán)境建立小鼠PTSD模型，每天將小鼠置于特定籠具中30 min后，加入使用過(guò)的貓砂暴露90 min，進(jìn)行恐懼記憶訓(xùn)練。5 d后在無(wú)氣味的籠具中進(jìn)行睡眠分析。模型小鼠出現(xiàn)過(guò)度覺(jué)醒（覺(jué)醒時(shí)間增加，覺(jué)醒期間腦電θ波和γ波比例增加）、睡眠質(zhì)量降低（NREM睡眠減少，NREM睡眠中δ波比例降低，β波比例升高）和睡眠節(jié)律紊亂（夜間睡眠時(shí)間增加），模擬了PTSD患者的睡眠障礙。

1.4 水面平臺(tái)

水面平臺(tái)法是經(jīng)典的睡眠剝奪方法，最初以貓為模型動(dòng)物，后應(yīng)用于嚙齒類［14］。該實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)初衷是選擇性剝奪REM睡眠，經(jīng)過(guò)改良后，目前常用的方法是將大鼠或小鼠置于略高于水面的小平臺(tái)上（常用直徑為大鼠6.5 cm，小鼠2.4 cm），REM睡眠時(shí)肌肉張力的喪失使動(dòng)物接觸水面或落水而被喚醒，REM睡眠被選擇性剝奪。對(duì)照動(dòng)物放置在一個(gè)更大的平臺(tái)上，并在水面上放置鐵網(wǎng)，允許快速眼動(dòng)睡眠發(fā)生，同時(shí)排除隔離、活動(dòng)限制和潮濕環(huán)境等應(yīng)激因素造成的影響［15-16］。由于造模過(guò)程中REM睡眠剝奪和其他應(yīng)激因素的積累，動(dòng)物返回飼養(yǎng)環(huán)境后可出現(xiàn)短時(shí)間睡眠障礙，伴有活動(dòng)亢進(jìn)、躁動(dòng)不安和攻擊性增強(qiáng)等應(yīng)激行為［17］。

1.5 慢性不可預(yù)知應(yīng)激

長(zhǎng)期、反復(fù)出現(xiàn)的日常壓力是抑郁癥和慢性失眠的重要誘因。抑郁癥和失眠之間存在密切關(guān)聯(lián)，抑郁癥患者常出現(xiàn)頻繁覺(jué)醒（碎片化睡眠），NREM睡眠中δ波減少和REM睡眠時(shí)間增加［18］。慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型最初由KATZ等［19］以大鼠為模型動(dòng)物建立，通過(guò)反復(fù)、隨機(jī)施加禁食、禁水、夾尾、強(qiáng)迫游泳、潮濕墊料和電擊等應(yīng)激因素使動(dòng)物出現(xiàn)抑郁樣行為，同時(shí)具有睡眠碎片化、深睡眠減少和REM睡眠增加的失眠表現(xiàn)［20］。NOLLET等［21］采用該方法建立小鼠慢性應(yīng)激模型，應(yīng)激因素包括傾斜籠具、潮濕墊料、天敵氣味、無(wú)墊料飼養(yǎng)、水環(huán)境飼養(yǎng)和活動(dòng)限制等，造模時(shí)間為9周，從睡眠、一般狀態(tài)、行為和內(nèi)分泌等多個(gè)角度選擇了46個(gè)指標(biāo)對(duì)模型動(dòng)物進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，REM睡眠、皮質(zhì)酮分泌和皮毛狀態(tài)等指標(biāo)對(duì)慢性應(yīng)激最為敏感。模型動(dòng)物的睡眠改變主要表現(xiàn)為REM睡眠時(shí)間和睡眠總時(shí)間顯著增加，但NREM睡眠片段數(shù)量增加，持續(xù)時(shí)間縮短，提示睡眠呈現(xiàn)碎片化趨勢(shì)，睡眠深度降低。

2 特殊環(huán)境失眠模型

大腦接收的環(huán)境信息可對(duì)睡眠的發(fā)生和維持產(chǎn)生重要影響，環(huán)境中的聲音、氣味、溫度和氧含量異常均可導(dǎo)致睡眠障礙。

2.1 噪聲暴露

人類睡眠對(duì)聲音刺激非常敏感，同樣，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將大鼠暴露于環(huán)境噪聲或人工合成的寬頻噪聲中可顯著減少其NREM和REM睡眠［22］。睡眠剝奪的噪聲強(qiáng)度一般為85～90 dB，為避免動(dòng)物對(duì)噪聲產(chǎn)生適應(yīng)，所用聲音多為不同性質(zhì)、強(qiáng)度和頻率的噪聲的隨機(jī)組合，可包括交通噪聲、警報(bào)、音樂(lè)和人工合成噪聲等［23］。長(zhǎng)期暴露于噪聲環(huán)境可對(duì)睡眠造成永久性影響，暴露于環(huán)境噪聲9 d后，大鼠NREM睡眠和REM睡眠長(zhǎng)期維持在較低水平，睡眠碎片化程度增加［24-25］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠噪聲暴露36 d后，睡眠結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，NREM睡眠比例降低而REM睡眠比例升高［23］。

2.2 低溫暴露

體溫調(diào)節(jié)對(duì)睡眠和覺(jué)醒狀態(tài)的維持同樣發(fā)揮重要作用，總體而言，低溫環(huán)境中嚙齒類動(dòng)物睡眠減少，覺(jué)醒增加，而高溫環(huán)境則促進(jìn)睡眠，本文主要討論低溫對(duì)睡眠的影響。大鼠暴露于低溫（-10～10℃）環(huán)境中24～48 h，覺(jué)醒時(shí)間顯著增加，NREM睡眠時(shí)間減少，REM睡眠被大幅抑制［26］。低溫對(duì)2種睡眠時(shí)相的影響并不一致，REM睡眠時(shí)間與環(huán)境溫度壓力呈負(fù)相關(guān)，而低溫對(duì)NREM睡眠的影響主要表現(xiàn)為δ波功率降低，提示低溫主要影響NREM睡眠的深度，而非持續(xù)時(shí)間［26］。低溫同樣抑制小鼠睡眠，增加覺(jué)醒。SATO等［27］研究表明，與對(duì)照組（環(huán)境溫度27℃）相比，低溫暴露組（環(huán)境溫度20℃）小鼠在夜間的睡眠總時(shí)間、NREM睡眠時(shí)間和REM睡眠時(shí)間均下降，而2種睡眠時(shí)相的片段數(shù)量和片段平均時(shí)長(zhǎng)未受顯著影響。

2.3 低壓低氧暴露

高原低壓低氧特殊環(huán)境常導(dǎo)致睡眠障礙，是高原病的主要表現(xiàn)之一，初次進(jìn)入高原地區(qū)人群的失眠發(fā)生率＞30%［28］，主要特點(diǎn)為睡眠維持困難、睡眠中呼吸暫停、周期性呼吸和多夢(mèng)等。在實(shí)驗(yàn)室模擬的低壓低氧環(huán)境中也可誘導(dǎo)大鼠失眠，ROY等［29］使用動(dòng)物低壓氧倉(cāng)模擬約海拔7600 m環(huán)境（氣壓37.6 kPa，氧分壓7.9 kPa），大鼠暴露7或14 d后，在常壓常氧條件下進(jìn)行12 h睡眠分析。結(jié)果表明，2組大鼠均出現(xiàn)睡眠總時(shí)間減少，覺(jué)醒時(shí)間和睡眠潛伏期增加，在睡眠結(jié)構(gòu)上都表現(xiàn)為深睡眠和REM睡眠占比下降，淺睡眠比例增加。另一項(xiàng)研究使用無(wú)線生理信號(hào)采集技術(shù)對(duì)大鼠睡眠進(jìn)行分析，在模擬的海拔7620 m環(huán)境中，大鼠睡眠總時(shí)間、NREM睡眠時(shí)間和REM睡眠時(shí)間均明顯縮短，覺(jué)醒時(shí)間增加［30］。

3 藥物失眠模型

睡眠的調(diào)節(jié)涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，主要的促醒核團(tuán)包括5-羥色胺能中縫核、腦橋被蓋核、去甲腎上腺素能藍(lán)斑核、組胺能結(jié)節(jié)狀核和多巴胺能腹側(cè)被蓋區(qū)。作用于這些系統(tǒng)的藥物可影響睡眠時(shí)間和睡眠結(jié)構(gòu)，用于模擬失眠癥的某些特征。

3.1 咖啡因

腺苷是腦內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，腺苷的積累是睡眠壓力形成的主要原因?？Х纫蚴窍佘帐荏w拮抗劑，通過(guò)結(jié)合腺苷A2A受體抑制睡眠，增強(qiáng)覺(jué)醒?？Х纫蛟谌撕蛧X類動(dòng)物中均可導(dǎo)致睡眠潛伏期延長(zhǎng)，睡眠時(shí)間減少和睡眠效率降低，能簡(jiǎn)單有效地模擬失眠癥入睡困難的癥狀［31］。研究表明，大鼠ig給予咖啡因（3，10和30 mg·kg-1）后，睡眠潛伏期顯著延長(zhǎng)，NREM睡眠減少，覺(jué)醒次數(shù)增加，高劑量咖啡因能夠同時(shí)減少REM睡眠，NREM和REM睡眠片段平均持續(xù)時(shí)間縮短，片段數(shù)量無(wú)明顯變化，給藥6 h后睡眠結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常［32］?？Х纫颍?0 mg·kg-1）同樣能引起小鼠睡眠障礙，表現(xiàn)為覺(jué)醒時(shí)間增加，睡眠總時(shí)間、NREM睡眠時(shí)間和REM睡眠時(shí)間減少［33］。

3.2 對(duì)氯苯丙氨酸（parachlorophenylalanine，PCPA）

PCPA可選擇性地作用于色氨酸羥化酶，阻礙5-羥色胺合成，ip給予PCPA可引起嚙齒類動(dòng)物嚴(yán)重失眠，由于其操作簡(jiǎn)單，效果明確，在研究中應(yīng)用比較廣泛。PCPA造模常用劑量為每日300～400 mg·kg-1，連續(xù)給藥3 d，末次給藥12 h后進(jìn)行戊巴比妥鈉協(xié)同催眠實(shí)驗(yàn)，以入睡潛伏期延長(zhǎng)和睡眠持續(xù)時(shí)間縮短為造模成功標(biāo)志，模型動(dòng)物可出現(xiàn)毛發(fā)變黃、食量減少、易驚覺(jué)、體質(zhì)量變輕等行為和一般狀態(tài)改變［34-35］。

3.3 酒精暴露與戒斷

睡眠障礙在酒精依賴癥患者中普遍存在，在戒斷期也可出現(xiàn)，這一現(xiàn)象同樣存在于嚙齒類動(dòng)物中。研究表明，急性酒精暴露可導(dǎo)致大鼠睡眠潛伏期縮短，NREM睡眠時(shí)間增加和REM睡眠時(shí)間縮短，此效應(yīng)具有劑量依賴性。長(zhǎng)期酒精暴露（3～6周）對(duì)大鼠NREM睡眠無(wú)顯著影響，但可降低δ，θ和β頻段的腦電波功率［36］。

酒精戒斷可導(dǎo)致一過(guò)性睡眠減少和覺(jué)醒增加，在小鼠模型中，長(zhǎng)期反復(fù)酒精暴露和戒斷導(dǎo)致睡眠總時(shí)間被大幅抑制，出現(xiàn)NREM睡眠減少，REM睡眠增加等睡眠結(jié)構(gòu)紊亂［37］。SANCHEZ-ALAVEZ等［38］使用酒精蒸氣吸入法構(gòu)建大鼠酒精暴露與戒斷模型，將大鼠飼養(yǎng)于密閉艙室內(nèi)，每天08∶00 pm-10∶00 pm向艙內(nèi)注入95%酒精蒸氣，持續(xù)8周，期間大鼠平均血液酒精濃度為（182.3±6.9）mg·dL-1。造模完成后24 h進(jìn)行睡眠腦電分析，模型組大鼠覺(jué)醒顯著增加，睡眠碎片化程度增強(qiáng)（NREM和REM睡眠片段持續(xù)時(shí)間縮短，腦電頻率升高），睡眠過(guò)程中θ和β波頻率升高。

4 展望

大鼠、小鼠等嚙齒類動(dòng)物的睡眠特征與人類存在天然的差異，因此動(dòng)物模型只能部分模擬人類失眠的特征。但在睡眠穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、對(duì)內(nèi)源性和環(huán)境因素的敏感性以及對(duì)促醒和催眠藥物的反應(yīng)等方面，人類與嚙齒類動(dòng)物的睡眠有很多相似之處，這是使用動(dòng)物模型進(jìn)行失眠研究的前提［39］。

針對(duì)失眠機(jī)制研究和鎮(zhèn)靜催眠藥物評(píng)價(jià)而構(gòu)建的動(dòng)物失眠模型數(shù)量有限，因此本文納入了其他可導(dǎo)致動(dòng)物睡眠障礙或睡眠剝奪的實(shí)驗(yàn)方法，基于這些方法構(gòu)建的動(dòng)物模型可模擬失眠癥的某些特征，部分模型可用于評(píng)價(jià)鎮(zhèn)靜催眠藥物的療效和作用特點(diǎn)，如束縛應(yīng)激、PTSD、“第一晚效應(yīng)”和水面平臺(tái)等方法建立的失眠模型均有用于藥物鎮(zhèn)靜催眠作用評(píng)價(jià)的研究。

理想的動(dòng)物模型應(yīng)能模擬失眠的主要癥狀，且對(duì)陽(yáng)性藥敏感，能在用藥劑量、作用特點(diǎn)和副作用等方面為候選藥物的臨床應(yīng)用提供參考。用于構(gòu)建模型的實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)盡可能簡(jiǎn)單、高效、安全，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理。構(gòu)建動(dòng)物失眠模型面臨的主要問(wèn)題是如何使模型動(dòng)物在睡眠時(shí)間充足、環(huán)境適宜的條件下出現(xiàn)睡眠時(shí)間和質(zhì)量的下降。在多數(shù)睡眠剝奪模型中，如強(qiáng)迫游泳、跑臺(tái)睡眠剝奪等，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物睡眠壓力持續(xù)積累，而睡眠被人為限制，在睡眠剝奪因素消失后可出現(xiàn)睡眠反彈。此類模型無(wú)法評(píng)價(jià)藥物對(duì)睡眠的直接影響，但可用于研究藥物對(duì)睡眠剝奪所致生物節(jié)律、腸道菌群或能量代謝等各方面異常的改善作用。本文涉及的失眠動(dòng)物模型均有一定的局限性，任何單一動(dòng)物模型都無(wú)法完全模擬失眠癥的所有特征。因此，需在研究中綜合運(yùn)用多種造模方法構(gòu)建失眠模型，同時(shí)重視對(duì)動(dòng)物行為和一般狀態(tài)的觀察分析，盡可能完整再現(xiàn)失眠癥的臨床表現(xiàn)，建立多種分析指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)候選藥物的作用特點(diǎn)。