KLF4在腫瘤研究中的進(jìn)展①

楊 帆 ，馮心河綜述， 肖勝軍審校

(1.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科，廣西 桂林 541199；2.桂林醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541199)

Krüppel樣因子 (Krüppel-like factor, KLFs) 得名于果蠅同源基因Krüppel，一般作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。Krüppel-like factor 4(KLF4)是近年來研究較多的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，是人類已鑒定的17個KLFs的成員之一。KLF4又名上皮鋅指蛋白EZF(Epithelial Zinc Finger Protein EZF)，因其在胃腸道組織表達(dá)較高，也被稱為胃腸富集Krüppel樣因子(Gut enriched Krüppel like factor, GKLF )。近年來針對KLF4蛋白的研究較多，其作為轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞增殖、分化以及凋亡，腫瘤的發(fā)生與惡性進(jìn)展，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程中有重要作用。筆者對KLF4的功能進(jìn)行了綜述。

1 KLF4蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

KLF4基因位于人染色體9q31，長度為5.6 kb，編碼的KLF4蛋白長度為513個氨基酸殘基。人KLF4蛋白與小鼠KLF4蛋白高度同源。據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計數(shù)據(jù)(https://www.uniprot.org/uniprot/O43474#function)，小鼠KLF4蛋白長度為483個氨基酸殘基，二者羧基端的113個氨基酸完全一致。與KLF家族的其他蛋白一樣，KLF4的氨基端高度變異，其125～149位氨基酸殘基富含絲氨酸，179～415位富含脯氨酸，其101～109位氨基酸殘基為1個9aatad組件，該組件可以抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。KLF4羧基端高度保守，包含3個Cys2-His2鋅指結(jié)構(gòu)(第430～454、460～484、490～512位氨基酸殘基)，每個鋅指結(jié)構(gòu)包含1個β折疊和1個α螺旋。KLF4蛋白含有2個核定位信號，第1個位于鋅指結(jié)構(gòu)內(nèi)，另1個位于鋅指結(jié)構(gòu)的前方。因此，鋅指結(jié)構(gòu)的作用除了可以直接結(jié)合DNA之外，還可能與KLF4蛋白的核定位信號有關(guān)。

2 KLF4的生物學(xué)功能

KLF4在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、維持正常組織的穩(wěn)態(tài)和凋亡等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用[1]。在胚胎發(fā)育的過程中，KLF4高表達(dá)于胃腸道、皮膚組織[2]，參與皮膚組織的發(fā)生、發(fā)育與分化成熟[3]。在睪丸組織中，KLF4高表達(dá)于支持細(xì)胞和減數(shù)分裂后的生殖細(xì)胞；KLF4在睪丸組織中被敲除后，可導(dǎo)致睪丸發(fā)育遲緩、雄配子數(shù)減少與精母細(xì)胞凋亡增多，說明KLF4在睪丸組織分化及雄性配子成熟過程中有重要作用[4]。KLF4在胸腺細(xì)胞和成熟T細(xì)胞中高表達(dá)，在T細(xì)胞被激活后表達(dá)下調(diào)，表明KLF4在T細(xì)胞發(fā)育和分化過程中發(fā)揮作用[5]。此外，KLF4在角膜、血管內(nèi)皮等組織均有不同程度的表達(dá)[2]。

KLF4常作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，其羧基端的鋅指結(jié)構(gòu)可以直接結(jié)合DNA，促進(jìn)或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄[2]。KLF4在DNA上的最小結(jié)合序列為5′-G/AG/AGGC/TGC/T-3′，該序列存在于許多基因的啟動子中，提示KLF4可能參與了這些基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。一方面，KLF4可以作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄，比如在T細(xì)胞成熟過程中，KLF4與IL-17A的啟動子結(jié)合，并促進(jìn)IL-17A的表達(dá)；在胸腺的發(fā)育過程中，KLF4促進(jìn)Cdkn1b的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)胸腺細(xì)胞增殖[5]。另一方面，KLF4又可以作為抑制因子抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，比如KLF4與CYP1A1基因結(jié)合序列同其轉(zhuǎn)錄激活因子Sp1識別序列重疊，KLF4競爭性抑制Sp1與啟動子的結(jié)合，從而抑制CYP1A1基因的表達(dá)[6]。KLF4作為一個轉(zhuǎn)錄因子，關(guān)于其促進(jìn)或是抑制目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的研究較多，這些研究數(shù)據(jù)可以充分表明KLF4對基因表達(dá)的調(diào)控具有雙向作用。

通過對相關(guān)靶基因的調(diào)控，KLF4參與了多種生理及病理生理過程，比如KLF4負(fù)性調(diào)控細(xì)胞的增殖能力。在腸上皮細(xì)胞中，KLF4在黏膜絨毛邊緣的分化上皮細(xì)胞中高表達(dá)，這些絨毛細(xì)胞已經(jīng)停止有絲分裂，提示KLF4與生長停止有關(guān)[3]。有研究通過微陣列分析KLF4的表達(dá)譜，KLF4激活了許多編碼細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子的基因，并抑制促細(xì)胞周期基因的表達(dá)；此外，對KLF4轉(zhuǎn)錄譜的進(jìn)一步研究揭示，KLF4在調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)和膽固醇生物合成在內(nèi)的大分子合成基因群的表達(dá)方面，對細(xì)胞增殖具有整體抑制作用[7]。這些觀察表明KLF4是細(xì)胞增殖的抑制因子。

但是，KLF4也可以通過抑制凋亡來促進(jìn)細(xì)胞生存。有研究發(fā)現(xiàn)，KLF4可以直接抑制TP53和BAX的表達(dá)，抑制p53依賴的凋亡通路[8]。另有研究表明，在HDAC抑制劑誘導(dǎo)的半胱氨酸蛋白酶激活后，KLF4通過作用CDKN1C基因抑制SAPK通路，從而抑制細(xì)胞凋亡[9]。因此，KLF4在細(xì)胞內(nèi)具體表現(xiàn)出哪種活性取決于其所處的細(xì)胞環(huán)境，以及與其他生物因子的相互作用。

此外，KLF4還能調(diào)節(jié)上皮及間質(zhì)細(xì)胞的分化。如前所述，在小腸隱窩中，隱窩底部具有增殖能力的腸干細(xì)胞低表達(dá)KLF4，但在增殖較弱的絨毛邊緣，KLF4高表達(dá)，提示KLF4的表達(dá)參與了小腸上皮細(xì)胞的分化[3]。在皮膚組織中，KLF4在上皮細(xì)胞分化調(diào)控中有重要作用，KLF4敲除小鼠由于喪失皮膚屏障功能，在出生后不久就因脫水死亡[10]。有研究表明，KLF4的敲除選擇性地擾亂了表皮分化晚期的結(jié)構(gòu)，而對表皮已知的結(jié)構(gòu)沒有任何形態(tài)學(xué)上的改變[11]。有研究發(fā)現(xiàn)在角膜、晶狀體和結(jié)膜的表面外胚層結(jié)構(gòu)中敲除KLF4后，可導(dǎo)致角膜脆性增加、基質(zhì)水腫、晶狀體缺損和結(jié)膜杯狀細(xì)胞丟失；此外，該研究者還發(fā)現(xiàn)，敲除KLF4后，角膜脆性增加的原因與表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的分化障礙有關(guān)[12]。這些研究皆表明，KLF4在小腸隱窩、角膜等上皮的分化過程中有重要作用。

除了參與細(xì)胞的增殖、分化等過程外，KLF4還參與了細(xì)胞DNA的損傷修復(fù)。在受放射損傷的小鼠腸道組織內(nèi)，當(dāng)DNA輕度損傷時，p53轉(zhuǎn)錄激活KLF4，KLF4表達(dá)上調(diào)，與p53相互作用，激活p21，阻滯細(xì)胞周期，利于細(xì)胞啟動修復(fù)程序，修復(fù)受損傷的DNA；相反，當(dāng)DNA損傷不可修復(fù)時，KLF4與HuR(RNA結(jié)合蛋白)結(jié)合減少，KLF4-mRNA穩(wěn)定性下降，KLF4表達(dá)下降，致使p53激活基因BAX，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。

3 KLF4在腫瘤中的作用

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，KLF4既可以成為癌基因，誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展，也可以作為抑癌基因，在腫瘤的發(fā)生過程中低表達(dá)或者缺失。KLF4具體作為癌基因還是抑癌基因發(fā)揮作用，與其所處細(xì)胞微環(huán)境、染色質(zhì)狀態(tài)以及其他相關(guān)基因的表達(dá)情況有關(guān)，具體機(jī)制目前尚不明確。

有研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，KLF4低表達(dá)，而在癌旁非癌組織中，KLF4強(qiáng)表達(dá)[14]。該研究還發(fā)現(xiàn)，在癌與癌旁組織中，KLF4與SP1的表達(dá)相互排斥，即SP1高表達(dá)于腫瘤組織，低表達(dá)于癌旁組織中。KLF4的表達(dá)在啟動子活性、mRNA和蛋白水平上均抑制了SP1的表達(dá)，其可能機(jī)制如前所述，KLF4的結(jié)合序列和SP1啟動子結(jié)合位點(diǎn)重疊，KLF4競爭性抑制SP1與啟動子的結(jié)合，進(jìn)而抑制SP1的表達(dá)[6]。這些結(jié)果表明，KLF4在胃腸道癌中發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用，其表達(dá)缺失可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。另外，除了在胃癌中表現(xiàn)出其抑癌基因的作用，有研究發(fā)現(xiàn)KLF4的表達(dá)失調(diào)與胰腺癌的去分化有關(guān)[15]。在肺癌中，大多數(shù)原發(fā)性肺癌組織中KLF4蛋白和mRNA水平顯著降低，KLF4基因敲除促進(jìn)永生化人支氣管上皮細(xì)胞生長[16]。該研究通過體外轉(zhuǎn)染，將KLF4基因?qū)敕伟┘?xì)胞中，強(qiáng)迫表達(dá)，并觀察到腫瘤的生長受到抑制。以上數(shù)據(jù)表明，KLF4在腫瘤發(fā)生過程中，作為抑癌基因可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

盡管KLF4被反復(fù)證明是一個抑癌基因，但同樣也被證明在許多腫瘤中表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤惡性行為的能力。有研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚組織中，基底層角質(zhì)形成細(xì)胞中KLF4的過表達(dá)可以導(dǎo)致鱗狀上皮異型增生，最終可導(dǎo)致鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生；此外，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，KLF4高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，KLF4高表達(dá)的口腔鱗癌患者5年生存率下降[10]。KLF4在70%的乳腺癌中表達(dá)增加，其核表達(dá)的增加提示腫瘤具有更好的侵襲性，更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。有研究通過小鼠移植成瘤實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了KLF4基因敲除可以抑制乳腺癌的發(fā)育，提示KLF4在乳腺癌中的表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展[17]。如前所述，KLF4通常被認(rèn)為是胰腺癌發(fā)展過程中的抑癌因子，但在侵襲性胰腺癌細(xì)胞和人胰腺腫瘤組織中，KLF4的亞型KLF4α表達(dá)上調(diào)，KLF4α可以促進(jìn)小鼠胰腺腫瘤的生長，其表達(dá)與胰腺癌患者生存時間減少有關(guān)[18]。以上數(shù)據(jù)表明，在腫瘤的發(fā)生過程中，KLF4也可以作為癌基因發(fā)揮作用。

KLF4與其他3個因子(Oct4；Sox2；c-Myc)一起可誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞及胃細(xì)胞為多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells，iPS)，也可誘導(dǎo)人體真皮成纖維細(xì)胞為iPS細(xì)胞。有研究表明，KLF4通過靶向作用hTERT，直接激活正常干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞中的端粒酶活性，進(jìn)而維持細(xì)胞的增殖潛能[19]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在激活端粒酶表達(dá)的過程中，KLF4主要是通過與β-catenin的相互作用，β-catenin再結(jié)合到hTERT的啟動子上調(diào)控其轉(zhuǎn)錄[20]。另有研究表明，KLF4可以激活Nanog的表達(dá)，Nanog是一個多能基因，其在干細(xì)胞中的表達(dá)可以維持干細(xì)胞干性特征[21]。此外，KLF4可以通過負(fù)性調(diào)控內(nèi)胚層分化基因Gata6和Sox17的表達(dá)，阻礙干細(xì)胞的分化[22]。以上數(shù)據(jù)提示KLF4在干細(xì)胞干性特征的誘導(dǎo)和維持、促進(jìn)腫瘤發(fā)生之間可能存在潛在關(guān)系。

KLF4在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epitehial-to-mesenchymal transition, EMT)的過程中能夠激活上皮基因的轉(zhuǎn)錄并且抑制間質(zhì)基因的表達(dá)。在肝細(xì)胞癌中，外源性KLF4的表達(dá)可以抑制其間質(zhì)的特征，使細(xì)胞形態(tài)改變?yōu)樯掀け硇?，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，反之敲除KLF4則增強(qiáng)其間質(zhì)特性并促進(jìn)細(xì)胞生長與遷移[23]。該研究進(jìn)一步對機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，KLF4可以結(jié)合并抑制slug啟動子的活性，異位表達(dá)的slug可部分逆轉(zhuǎn)KLF4介導(dǎo)的上皮樣表型。有研究表明，在乳腺癌中，KLF4通過減少snail(上皮間質(zhì)化與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵中介)的表達(dá)，從而抑制上皮-間質(zhì)化，進(jìn)而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[24]。同樣，有研究表明，在前列腺癌中，KLF4是slug表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制劑，單純的KLF4缺失就足以誘導(dǎo)slug依賴的EMT[25]。以上數(shù)據(jù)表明，KLF4可以在EMT過程起到抑制作用，從而可以降低腫瘤的侵襲、遷移能力，降低腫瘤的惡性能力。

KLF4是一個功能復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子，在不同的體內(nèi)微環(huán)境的影響下，它既可以是轉(zhuǎn)錄激活因子，也可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，在腫瘤的發(fā)生進(jìn)程中，既可以是原癌基因，也可以是抑癌基因。KLF4在正常細(xì)胞、癌細(xì)胞、干細(xì)胞重編程和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮作用的機(jī)制仍不明確，其作為原癌基因和抑癌基因之間轉(zhuǎn)換的分子基礎(chǔ)仍有待進(jìn)一步的研究。