防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞惡性生物學行為及HIF-1α/VEGF/Akt通路的相關(guān)性研究①

望永鼎 劉文華 翟一飛 張 濤

(商丘醫(yī)學高等?？茖W校外科，商丘 476000)

結(jié)腸癌是發(fā)生在結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率已經(jīng)是惡性腫瘤的第3位，死亡率已達第4位，并且其發(fā)病率和死亡率還呈逐年上升的趨勢，因此有必要尋找新的治療藥物[1]。防己諾林堿(Fangchinoline，F(xiàn)AN)是防己科防己干燥根中生物堿的主要提取物，其是一種結(jié)構(gòu)復雜的雙芐基異喹啉類生物堿，具有抗炎鎮(zhèn)痛、利尿消腫和抑制腫瘤等作用[2]。防己諾林堿可以通過多種信號通路來抑制多種腫瘤的發(fā)展：防己諾林堿通過抑制Akt和Akt介導的信號級聯(lián)反應的激酶活性來抑制人膠質(zhì)母細胞瘤細胞的生長和侵襲[3]；防己諾林堿通過抑制FAK的磷酸化來抑制黑色素瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移[4]；防己諾林堿通過抑制PI3K和下游信號通路抑制人骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和腫瘤發(fā)生等[5]。但是防己諾林堿對結(jié)腸癌作用并不清楚。低氧誘導因子1α(Hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)是一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，主要作為細胞氧平衡和缺氧誘導基因表達的中心調(diào)節(jié)子；血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)能夠促進腫瘤新血管的生成和通透性的增加，是HIF-1α的靶基因之一；蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt)是一種重要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，執(zhí)行血管生成，細胞代謝等各種細胞功能[6-9]。本文主要研究防己諾林堿對結(jié)腸癌的作用以及與HIF-1α/VEGF/Akt通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 PRMI1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購于深圳市偉通生物科技有限公司；BCA試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；Transwell小室購自美國 Corning 公司；Ki67、 PCNA、 E-cadherin、N-cadherin、 HIF-1α、VEGF、 Akt單克隆一抗和二抗均購自英國Abcam公司；免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.1.2儀器 MD全自動顯微鏡購自美國Molecu-lar Devices公司；超凈工作臺購自蘇州凈化設備廠。

1.1.3細胞 結(jié)腸癌細胞HT-29購自上海賽默生物科技發(fā)展有限公司；

1.1.4動物 40只裸鼠購自河南省醫(yī)療器械，許可證：SYXK(豫)2017-0010。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HT-29細胞培養(yǎng)于PRMI1640細胞培養(yǎng)基(含 10% FBS、1% 青霉素、1% 鏈霉素)中，在37℃、CO25%、飽和濕度90%的恒溫箱中培養(yǎng)到貼壁生長到 80%，便可消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2實驗分組及處理 設置Blank cells 組，F(xiàn)AN(5 μg/ml)組、FAN(10 μg/ml)組和FAN(20 μg/ml)組；Blank cells 組HT-29細胞正常培養(yǎng)；FAN(5 μg/ml)組、FAN(10 μg/ml)組和FAN(20 μg/ml)組HT-29細胞分別用5、10、20 μg/ml FAN處理48 h。

1.2.3克隆形成實驗 將HT-29細胞介入6孔板，約3×102個/孔。貼壁后分別加入含有5、10和20 μg/ml FAN的培養(yǎng)基孵育，2 d更換更換一次培養(yǎng)液。15 d后，棄去培養(yǎng)基，用4% 的多聚甲醛固定細胞，然后用結(jié)晶紫染色。拍照并計算克隆形成率：克隆形成率(%)=細胞克隆數(shù)均值/鋪板細胞總數(shù)×100%。

1.2.4Western blot檢測 將處理后的細胞沖洗后加入RIPA蛋白裂解液，離心之后取上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。每個樣本取30 μg進行SDS-PACE，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下用10% 脫脂奶粉封閉1 h；然后加入對應的一抗(Ki67、 PCNA、 E-cadherin、N-cadherin、 HIF-1α、VEGF、 Akt均稀釋1∶500，GAPDH為1∶1 000)4℃過夜；接著用磷酸緩沖液沖洗后加入HRP標記的二抗(1∶2 000)，室溫下孵育2 h；最后，ECL 顯影后掃描，蛋白相對表達量以GAPDH 為內(nèi)參校正后，經(jīng)Quantity-One軟件分析。

1.2.5Transwell檢測 取對數(shù)期的HT-29細胞，用胰蛋白酶消化后，離心棄上清，按照不同分組分別加入含有不同濃度FAN的不含有胎牛血清的細胞培養(yǎng)液懸浮細胞(濃度為2×105個/ml)，取200 μl加入上室，在外室加入500 μl含有 10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng) 48 h 后，將小室取出，用 90%的乙醇溶液固定；然后用 PBS 洗滌后；接著1%的結(jié)晶紫染色；最后，在顯微鏡下隨機選擇視野并計算侵襲細胞數(shù)目。

1.2.6體內(nèi)實驗 用1 ml注射器吸取配制好的細胞懸液0.2 ml，向小鼠的右側(cè)腋窩皮下注射，在注射局部可觸及明顯皮丘后迅速退針。接種5 d后，小鼠右腋下可觸及直徑約5 mm的皮下結(jié)節(jié)，提示建模成功。將40只造模成功的小鼠隨機分為4組，每組10只。每天腹腔注射0、5、10和20 μg/ml FAN 2 ml，培養(yǎng)32 d。檢測移植瘤體積：V=(長×寬2)/2；免疫組化檢測Ki67和VEGF；Western blot檢測HIF-1α、VEGF和Akt的表達。

1.2.7免疫組化檢測 將組織用中性甲醛溶液固定后，用石蠟包埋；然后將石蠟包埋的組織塊切片；接著石蠟切片脫蠟水化，阻斷過氧化物酶，抗原修復，血清封閉分別加入Ki67和VEGF單抗，4℃過夜，加入二抗，加入生物素蛋白工作液，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片；最后在顯微鏡下觀察統(tǒng)計。

1.2.8HE染色 將腎組織和肝組織放置4%甲醛固定后用酒精梯度脫水，然后用石蠟包埋切片。將石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、酒精覆水、蘇木精染色、乙酸分化、返藍、伊紅染色后，脫水固定裝片，顯微鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方面方差分析及t檢驗，P<0.05，為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞HT-29生長的影響 通過克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)：與Blank cells組相比，F(xiàn)AN組的結(jié)腸癌細胞HT-29克隆形成率顯著降低，說明防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞HT-29的克隆形成(P<0.01，圖1A)；隨著防己諾林堿濃度的升高，結(jié)腸癌細胞HT-29克隆形成率逐漸降低，說明防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞HT-29克隆形成的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖1A)。

通過Western blot檢測增殖標記蛋白Ki67和PCNA的表達結(jié)果顯示：與Blank cells組相比，F(xiàn)AN組的結(jié)腸癌細胞HT-29Ki67和PCNA的表達量顯著下調(diào)，說明防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞HT-29的增殖(P<0.01，圖1B)；隨著防己諾林堿濃度的升高，結(jié)腸癌細胞HT-29的Ki67和PCNA表達量逐漸降低，說明防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞HT-29增殖的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖1B)。

2.2防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞HT-29侵襲的影響 通過Transwell檢測細胞侵襲情況可知：與Blank cells組相比，F(xiàn)AN組的結(jié)腸癌細胞HT-29侵襲細胞數(shù)目顯著減少，說明防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞HT-29的侵襲能力(P<0.01，圖2)；隨著防己諾林堿濃度的升高，結(jié)腸癌細胞HT-29侵襲細胞數(shù)目逐漸減少，說明防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞HT-29侵襲能力的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖2)。

2.3防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞HT-29 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 通過Western blot檢測VEGF、E-cadherin和 N-cadherin的表達發(fā)現(xiàn)：與Blank cells組相比，F(xiàn)AN組的結(jié)腸癌細胞HT-29的VEGF和N-cadherin表達量顯著下調(diào)，E-cadherin表達量顯著上調(diào)，說明防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞HT-29上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(P<0.01，圖3A)；隨著防己諾林堿濃度的升高，結(jié)腸癌細胞HT-29的VEGF和N-cadherin表達量逐漸降低，E-cadherin表達量逐漸上調(diào)，說明防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞HT-29上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖3A)。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：與Blank cells組相比，F(xiàn)AN組的結(jié)腸癌細胞HT-29的排列緊密，說明防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞HT-29上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；隨著防己諾林堿濃度的升高，結(jié)腸癌細胞HT-29的排列逐漸變得緊密，說明防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞HT-29上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖3B)。這與Western blot檢測VEGF、E-cadherin和 N-cadherin的表達結(jié)果相一致。

圖1 防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞HT-29生長的影響Fig.1 Effect of feninoline on growth of colon cancer cell line HT-29Note:A.Cell growth was detected by a colony formation assay;B.Ki67 and PCNA expression was detected by Western blot;**.P<0.01 versus Blank cells group.

圖2 Transwell檢測細胞侵襲情況(40倍)Fig.2 Detection of cell invasion by Transwell(40 times)Note:**.P<0.01 versus Blank cells group.

2.4防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞HT-29的作用通路 通過Western blot檢測HIF-1α、VEGF和Akt的表達結(jié)果可知：與Blank cells組相比，F(xiàn)AN組的結(jié)腸癌細胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表達量顯著下調(diào)，說明防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞HIF-1α、VEGF/Akt信號通路的激活(P<0.01，圖4)；隨著防己諾林堿濃度的升高，結(jié)腸癌細胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表達量逐漸降低，說明防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞HT-29HIF-1α/VEGF/Akt信號通路激活的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖4)。

2.5防己諾林堿在體內(nèi)對結(jié)腸癌細胞HT-29的影響 通過移植瘤體積測定發(fā)現(xiàn)：所有組的移植瘤體積隨著天數(shù)增多在不斷變大，但是FAN組的移植瘤體積與Blank組相比整體較小，說明防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞在體內(nèi)的生長(圖5A、B)。通過免疫組化檢測Ki67和VEGF發(fā)現(xiàn)：與Blank組相比，F(xiàn)AN組的結(jié)腸癌細胞Ki67和VEGF陽性細胞所占百分比顯著減少，說明防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞HT-29的增殖(P<0.01，圖5C)；隨著防己諾林堿濃度的升高，結(jié)腸癌細胞HT-29的Ki67和VEGF陽性細胞所占百分比逐漸減少，說明防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞HT-29增殖的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖5C)。這與體外實驗結(jié)果相一致。通過Western blot檢測HIF-1α、VEGF、Akt的表達結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與Blank組相比，F(xiàn)AN組的結(jié)腸癌細胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表達量顯著下調(diào)，說明防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞HIF-1α/VEGF/Akt信號通路的激活(P<0.01，圖5D)；隨著防己諾林堿濃度的升高，結(jié)腸癌細胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表達量逐漸降低，說明防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞HT-29HIF-1α/VEGF/Akt信號通路激活的抑制作用隨著濃度的升高而增強(圖5D)。這和體外實驗檢測結(jié)果完全一致。通過HE染色可知，Blank組大鼠的肝腎組織均結(jié)構(gòu)完整清晰，細胞界限分明，無腫脹、系膜增生、充血、炎癥細胞浸潤等病理特征，與Blank組相比，F(xiàn)AN組肝腎組織無明顯變化，說明該劑量的防己諾林堿對肝、腎無損傷，可以安全應用(圖5E)。

圖3 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化情況Fig.3 Epithelial-mesenchymal transitionNote:A.The expression of VEGF,E-cadherin and N-cadherin was detected by Western blot;B.The morphology of epithelial to mesenchymal transition was observed by microscope;**.P<0.01 versus Blank cells group.

圖4 Western blot檢測HIF-1α、VEGF、Akt的表達Fig.4 Detection of HIF-1α,VEGF,Akt expression by Western blotNote:**.P<0.01 versus Blank cells group.

圖5 防己諾林堿在體內(nèi)對結(jié)腸癌細胞HT-29的影響Fig.5 Effect of hexinoline on colon cancer cell line HT-29 in vivoNote:A.Tumor status of different groups;B.Tumor volume of different groups;C.Detection of Ki67 and VEGF by immunohistochemistry (400 times);D.Detection of expression of HIF-1α,VEGF,Akt by Western blot;E.Liver and kidney damage were observed by HE staining;**.P<0.01 versus Blank group.

3 討論

細胞的惡性生長增殖是腫瘤形成的重要原因，抑制腫瘤細胞的惡性生長增殖是抑制腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵，如，Yao等[10]發(fā)現(xiàn)山奈酚通過抑制食管鱗狀細胞癌細胞增殖來抑制食管鱗狀細胞癌發(fā)展。防己諾林堿可抑制乳腺腺癌、肺癌等腫瘤細胞的增殖[11]。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞HT-29的克隆形成。并且發(fā)現(xiàn)，防己諾林堿顯著下調(diào)結(jié)腸癌中Ki67和PCNA的表達量。Ki67和PCNA是眾所周知的評估細胞增殖的標記物。這進一步證明防己諾林堿可以抑制結(jié)腸癌細胞HT-29的增殖。

結(jié)腸癌在確診時通常伴有局部和遠處的侵襲轉(zhuǎn)移，且腫瘤術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移是導致結(jié)腸癌患者死亡的主要原因，所以，檢測藥物對結(jié)腸癌細胞的侵襲能力影響是治療結(jié)腸癌的關(guān)鍵[12]。Tian等[13]研究發(fā)現(xiàn)防己諾林堿靶向P13抑制胃癌細胞SGC7901的增殖和侵襲，推測防己諾林堿具有抑制結(jié)腸癌細胞侵襲的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，防己諾林堿明顯減少結(jié)腸癌細胞侵襲數(shù)目，證明防己諾林堿對結(jié)腸癌細胞HT-29的侵襲能力具有抑制作用。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是以得到間充質(zhì)干細胞特性、喪失上皮細胞特性為主要特征的生理病理現(xiàn)象，是腫瘤細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要證據(jù)[14]。如，Dinicola等[15]報道尼古丁通過上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化增加結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲。雖未有研究報道防己諾林堿對腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)防己諾林堿顯著下調(diào)結(jié)腸癌細胞HT-29的VEGF和N-cadherin表達量、上調(diào)E-cadherin表達量，說明防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞HT-29上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

HIF-1α/VEGF/Akt信號通路和癌癥的發(fā)展息息相關(guān)，如，He等[16]報道沒食子酸通過PTEN/HIF-1α/VEGF/Akt信號通路抑制卵巢癌發(fā)展，Lee等[17]發(fā)現(xiàn)京尼平通過抑制HIF-1α積累和VEGF表達抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲和遷移，從而抑制結(jié)腸癌。已有研究發(fā)現(xiàn)防己諾林堿通過Akt/GSK-3beta/cyclin D1信號通路抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖，誘導細胞凋亡[18]。本研究發(fā)現(xiàn)防己諾林堿顯著下調(diào)結(jié)腸癌細胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表達量，說明防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞HIF-1α/VEGF/Akt信號通路。

在體外實驗時，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)防己諾林堿可以抑制結(jié)腸癌細胞HT-29的生長和增殖、侵襲能力、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并且抑制結(jié)腸癌細胞HIF-1α/VEGF/Akt信號通路，從而抑制結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。為了取得更好的證據(jù)，進行了裸鼠體內(nèi)實驗。結(jié)腸癌體內(nèi)實驗模型通常是采用皮下注射構(gòu)建模型[19]，本文也采用此方法構(gòu)建了結(jié)腸癌移植瘤模型。通過腫瘤體積測定發(fā)現(xiàn)，給防己諾林堿的裸鼠的腫瘤體積顯著較小，這說明防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞在體內(nèi)的生長。通過免疫組化檢測Ki67和VEGF發(fā)現(xiàn)，防己諾林堿顯著降低結(jié)腸癌細胞HT-29 Ki67和VEGF陽性比率，說明防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞HT-29的增殖。通過Western blot檢測HIF-1α、VEGF、Akt的表達結(jié)果發(fā)現(xiàn)，防己諾林堿顯著下調(diào)結(jié)腸癌細胞HT-29的HIF-1α、VEGF和Akt表達量，說明防己諾林堿抑制結(jié)腸癌細胞HIF-1α/VEGF/Akt信號通路。這些結(jié)果與體外實驗結(jié)果一致。眾所周知，防己諾林堿大劑量或長期使用就會對肝腎有一定毒性，其中以肝損害為重，且損害程度與藥物劑量有一定正比關(guān)系，但我們通過HE染色實驗發(fā)現(xiàn)該劑量藥物對肝腎并無損害。

綜上所述，防己諾林堿無論是在體內(nèi)還是體外都可以抑制結(jié)腸癌細胞HT-29的生長和增殖、侵襲能力、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并且抑制結(jié)腸癌細胞HIF-1α/VEGF/Akt信號通路，從而抑制結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。這為防己諾林堿開發(fā)了新的應用市場，同時也為結(jié)腸癌的治療提供新的參考數(shù)據(jù)。