谷氨酸產(chǎn)生菌誘變技術(shù)的研究進展

覃菲菲

（廣西-東盟食品檢驗檢測中心，廣西南寧 530021）

誘變育種廣泛用于谷氨酸生產(chǎn)菌育種，是首選的育種方法，本文主要論述谷氨酸產(chǎn)生菌誘變技術(shù)的最新研究進展，根據(jù)對谷氨酸產(chǎn)生菌誘變的因子不同，可分為以下四大類：物理誘變技術(shù)；化學誘變技術(shù)；復合誘變技術(shù)；常壓室溫等離子體誘變技術(shù)。從各個方面綜合論述了誘變技術(shù)的原理、應用以及特點。探索新方法和新技術(shù)，為日后提高工業(yè)發(fā)酵谷氨酸的產(chǎn)量和開發(fā)優(yōu)質(zhì)谷氨酸產(chǎn)生菌株提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。

1 物理誘變

物理誘變技術(shù)是利用各種射線的輻射作用，如紫外線，X射線，γ 射線等，造成菌體的DNA 的結(jié)構(gòu)變化，從中篩選正向突變的突變體，最終獲得目的菌株。常用的物理誘變技術(shù)有紫外線誘變與X 射線誘變兩類。

紫外誘變是物理誘變技術(shù)的代表，也是一種有效的誘變手段。通過紫外誘變對出發(fā)菌體進行處理后，能獲得預期的結(jié)果，如副產(chǎn)物高產(chǎn)或改變菌體性狀。

設(shè)定一定劑量的紫外線對菌體輻射一段時間，紫外線即能引起DNA 變化，使菌株突變。紫外線引起的DNA 構(gòu)象變化很多，包括DNA 片段化，雙鏈DNA 分子交叉連接，胸腺嘧啶二聚體的形成等。杜軍等以GDK6菌作為出發(fā)菌株，通過紫外線定向誘變L-谷氨酸生產(chǎn)菌，結(jié)果GDK9菌株產(chǎn)酸能力提高且高產(chǎn)性狀遺傳穩(wěn)定，糖酸轉(zhuǎn)化率達到 62.2%。吳學超等把B6-1株經(jīng)過三輪紫外誘變，最終得到聚谷氨酸高產(chǎn)的突變株W003，聚谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)率從起始菌10.9g/L 提高到20.5g/L。

X 射線是波長介于紫外線和γ 射線 間的電磁輻射。同步輻射源可產(chǎn)生高強度的連續(xù)譜X 射線，使用其產(chǎn)生的X 射線直接對菌體輻照一段時間，使染色體斷裂，最終造成遺傳物質(zhì)變異。

同步輻射軟X 射線已被應用于微生物誘變。軟X 射線能量轉(zhuǎn)移密度比硬X 射線大，所以相對生物效應高。低能量的軟X 射線對菌體的DNA 中某些重要的微量元素具有特殊的吸收作用，從而導致在菌體細胞中產(chǎn)生更多的染色體畸變。劉苗等以SW07-1為原始菌株，經(jīng)過軟X 射線誘變，使菌株在生長過程中逐步適應較高的溫度，最終獲得耐高溫的谷氨酸突變菌株，達到育種目的。

2 化學誘變

化學誘變是通過分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的試劑開展的，引起遺傳物質(zhì)損傷或錯誤修復產(chǎn)生突變體，可導致基因突變，或選擇性作用于一個特定的基因、核酸。依據(jù)誘變劑與DNA 作用方式的不同可分為烷化劑誘變、移碼突變劑誘變兩大類。

烷化劑是化學誘變技術(shù)中最常用的試劑，包括硫酸二乙酯、亞硝基胍、亞硝基乙基脲、甲基磺酸甲酯等。為了提高菌株的正突變率，通常采用兩種或兩種以上烷化劑同時或交替使用，價格低廉、操作簡單、不需要復雜昂貴的儀器設(shè)備、效果明顯。

烷化劑在菌體內(nèi)能形成C2+或活潑親電性基團，實驗設(shè)定一定濃度的烷化劑加入菌體培養(yǎng)基中，菌體生長過程中，試劑可以與生物大分子中含有豐富電子的基團發(fā)生共價結(jié)合，使其喪失活性，或使DNA 分子發(fā)生斷裂。王衛(wèi)對菌株HG-009進行了化學誘變來提高γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量，通過2%的硫酸二乙酯（DES）誘變15min，將γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量由61.90mg/g 提升到71.39mg/g。朱麗娟以谷氨酸產(chǎn)生菌HD11為出發(fā)菌株，使用硫酸二乙酯對菌株進行單因子誘變，篩選出聚谷氨酸高產(chǎn)菌株F12，聚谷氨酸產(chǎn)率達到20.27g/L，比出發(fā)菌株高39.2%。

移碼突變劑具有平面三環(huán)結(jié)構(gòu)，以某種濃度加入菌株培養(yǎng)基后，隨著菌體的生長，試劑可插人到正常DNA 雙鏈分子臨近的堿基對之間，導致堿基突變，使遺傳密碼轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生錯誤，引起菌種性狀改變。Ferguson 等認為移碼突變更多可能發(fā)生在重復堿基區(qū)域內(nèi)。移碼突變劑主要包括吖啶黃、吖啶橙等吖啶類化合物以及原黃素、溴化乙錠等。于芳以谷氨酸產(chǎn)生菌ATCC13870為出發(fā)菌株，對其進行吖啶黃與紫外線復合誘變，定向選育然后篩選得到菌株Ⅱ-169，其酸產(chǎn)量達23.8g/L，較出發(fā)菌提高14.4%，副產(chǎn)物量降低了12.5%。

3 復合誘變

隨著研究的進展，誘變的手段更加多樣化，研究人員已不局限于單一因素對菌株的誘變。為了提高誘變的效果，通常使用兩個或兩個以上的誘變劑同時或依次作用，甚至是物理因子和化學因子配合來復合誘變的處理方法。

主要包括三個方面：多種物理因子誘變、物理—化學因子復合誘變、化學—物理—化學因子交叉復合誘變。李雪等利用CGMCC3336為出發(fā)菌株，通高鹽-高溫復合手段得到高轉(zhuǎn)化率菌株TKBCPG-009，新菌株能將發(fā)酵底物谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化率提高16%。喬長晟等以BCPG006 為起始菌株，通過紫外線和He-Ne 激光復合誘變處理，選育出的突變株BCPG078，發(fā)酵后所得聚谷氨酸的量為16g/L，為起始菌的2.67倍。張瑞等以γ-多聚谷氨酸解淀粉芽胞桿菌C1為出發(fā)菌株，對其進行紫外線-亞硝基胍復合誘變，通過復合誘變選育得到正突變菌株C1-6，其γ-PGA 的產(chǎn)量由18.4g/L 提高到24.2g/L，增加了31.5%。

物理誘變與化學誘變技術(shù)發(fā)展時間較長，各方面研究較成熟，所以谷氨酸菌誘變技術(shù)大部分首選二者進行復合誘變。根據(jù)當下的研究結(jié)果，綜合各種因子的復合誘變比單一因子誘變效果好。

4 常壓室溫等離子體誘變

隨著科技的發(fā)展，各學科間的交叉應用受到國內(nèi)外科學家的重視，研究出更先進、更復雜的技術(shù)，來適應更高的研究標準。目前研究中出現(xiàn)的新型誘變方法主要有：常壓室溫等離子體、高能電子流、超高壓、離子注入等。

其中常壓室溫等離子體（ARTP）在生物誘變育種領(lǐng)域得到廣泛應用[7]。ARTP 誘變技術(shù)有能夠有效造成DNA 多樣性的損傷，突變率高，并易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株，操作簡便成本低，無毒無害等優(yōu)點

常壓室溫等離子體（ARTP）能夠在大氣壓下產(chǎn)生溫度在25～40 ℃的具有高活性粒子濃度的等離子體射流。等離子體中的活性粒子作用于菌種，能夠使細胞膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并誘發(fā)細胞啟動SOS 修復機制，修復過程中會產(chǎn)生種類豐富的錯配位點，進而使DNA 序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)顯著變化，最終導致菌種突變。

陳雙喜等對γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌HD11進行等離子體誘變處理，獲得高產(chǎn)菌株HNCL1266，其γ-聚谷氨酸搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為26g/L，較出發(fā)菌提高了30%。梁玲等以谷氨酸棒桿菌GY1為研究對象，采用ARTP 進行全局誘變，經(jīng)過初篩與搖瓶復篩，獲得突變株YAG117，其發(fā)酵L-谷氨酸含量達16.3g/L，較出發(fā)菌株提高13.9%?？讕浀纫怨劝彼岚魲U菌23798為原始菌株，對其進行ARTP 誘變，發(fā)酵培養(yǎng)復篩48h，選育出一株高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變谷氨酸棒桿菌B1，L-異亮氨酸產(chǎn)量達18.5g/L，比原始菌株提高62.03%。杜丹清等以γ-聚谷氨酸地衣芽孢桿菌QY-27為出發(fā)菌株，通過常壓室溫等離子體（ARTP）誘變，篩選獲得一株高產(chǎn)菌株QS-21，γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量較出發(fā)菌株的9.12g/L 提高了42.26%。

ARTP 誘變技術(shù)是綜合了物理和化學誘變特性為一體的新方法，在擴大菌種源，優(yōu)良品種的篩選，及提高誘變效率等方面，將發(fā)揮重要的作用。隨著各學科間的合作日益普遍，高新技術(shù)已進入學科交叉研究時代，ARTP 誘變技術(shù)就是其中典型的例子，不久之后會得到更廣泛的應用。

5 結(jié)語

目前谷氨酸菌株育種還是采用誘變技術(shù)。因其具有簡便、易行、安全以及菌種遺傳穩(wěn)定性高等特點，每一種誘變技術(shù)的基本原理、作用機制均不相同，其中涉及到物理、化學、生物等多種學科，研究空間大，有利于應用實驗。誘變技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)相對成熟，但仍有突破點：復合誘變的可能性很大，可嘗試不同的組合進行實驗；當誘變效率低時，應考慮到誘變因子的參數(shù)設(shè)定；新技術(shù)如常壓室溫等離子體誘變等具體是何種效應引起的基因突變還未有明確定論，應加大基礎(chǔ)理論的研究；誘變技術(shù)存在局限性時，可考慮與其他技術(shù)結(jié)合使用；把原生質(zhì)體融合以及生物工程技術(shù)應用到誘變中。隨著學科間的交叉領(lǐng)域研究的深入，誘變技術(shù)技術(shù)在未來會有很大進展，可以選育出更高產(chǎn)和更高性能的谷氨酸產(chǎn)生菌株。