沙門(mén)氏菌致病性及檢測(cè)的研究進(jìn)展

宋佳春 周寧 麗敏

作者單位：1. 014030 內(nèi)蒙古 包頭，包頭市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.包頭市腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科

沙門(mén)菌屬是一類常見(jiàn)的腸道致病菌，可引發(fā)人類及動(dòng)物(家畜、鼠類及禽類等)致病。根據(jù)Kauffmann-White分型方案，目前沙門(mén)氏菌血清型已經(jīng)超過(guò)2 500多種，其中感染人類的沙門(mén)血清型有1 400多種，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)的沙門(mén)菌菌型約200多種[1]。沙門(mén)菌感染源主要來(lái)自于受污染的病畜及帶菌者。這類細(xì)菌于外界環(huán)境中的適應(yīng)能力強(qiáng)，在自然環(huán)境的糞便中可能存活1～2個(gè)月，污染肉類和乳制品后沙門(mén)菌可存活數(shù)月，甚至在腌制品中亦能存活2～3個(gè)月。夏、秋兩季，沙門(mén)菌是引起人類食物中毒致病菌中較為常見(jiàn)的細(xì)菌種類，可引發(fā)急性胃腸炎、傷寒、副傷寒、菌血癥或敗血癥等疾病[2]。其中，傷寒和副傷寒沙門(mén)菌是感染人類的主要類型。隨著人們生活水平的日益提升，盡管食品安全受到越來(lái)越高地重視，但全球每年由沙門(mén)氏菌引發(fā)急性胃腸炎病例仍有近1.15億次，致死病例為37萬(wàn)[3]。尤其在南非、印度及亞洲欠發(fā)達(dá)地區(qū)，傷寒沙門(mén)菌感染已成為全世界范圍內(nèi)的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[4-5]。2014年美國(guó)發(fā)生了由黃瓜作為污染源導(dǎo)致新港沙門(mén)菌感染爆發(fā)的報(bào)道[6]。長(zhǎng)期帶菌的機(jī)體一旦排出病菌，就會(huì)造成周?chē)h(huán)境的污染，致使環(huán)境呈有菌狀態(tài)，在條件適宜時(shí)就會(huì)引發(fā)疾病的發(fā)生和流行。為了讓人們更多地了解沙門(mén)菌的致病特性及感染入侵過(guò)程，繼而有效切斷沙門(mén)氏菌傳播途徑，預(yù)防沙門(mén)氏菌感染，本文從檢驗(yàn)學(xué)角度對(duì)該菌入侵途徑、致病機(jī)理、檢測(cè)方法等方面作一概述。

1 沙門(mén)氏菌的入侵途徑及致病性

1.1 沙門(mén)氏菌的入侵途徑 沙門(mén)菌是否引發(fā)疾病取決于被感染機(jī)體免疫狀態(tài)和侵入的細(xì)菌數(shù)量、種類和致病性等因素。根據(jù)侵入機(jī)體方式的差異，可將這類菌大致分為侵襲性沙門(mén)菌和非侵襲性沙門(mén)菌。侵襲性沙門(mén)菌是通過(guò)識(shí)別腸黏膜上皮細(xì)胞中捕獲抗原的微褶皺細(xì)胞(M細(xì)胞)而進(jìn)入上皮下組織；非侵襲性沙門(mén)菌的侵入則利用樹(shù)突細(xì)胞打開(kāi)上皮細(xì)胞間的緊密聯(lián)接，從打開(kāi)的縫隙中伸出樹(shù)突，將腸腔中的細(xì)菌直接攝入[7]。侵入機(jī)體后菌體在腸系膜淋巴組織和吞噬細(xì)胞中存活并繁殖，嚴(yán)重者經(jīng)淋巴液、血液系統(tǒng)進(jìn)入肝、脾等組織，造成全身性感染。對(duì)于不同血清型的沙門(mén)菌來(lái)說(shuō)，其所致的疾病類型亦有所不同，如傷寒沙門(mén)菌和副傷寒沙門(mén)菌感染主要導(dǎo)致腸熱癥，而豬霍亂沙門(mén)菌感染多引發(fā)急性胃腸炎等疾病[8]。

1.2 沙門(mén)氏菌的致病性 傷寒是沙門(mén)菌中較為常見(jiàn)的菌種，它所具有的Vi抗原是一種酸性多糖聚合體，很不穩(wěn)定，一般認(rèn)為與毒力有關(guān)。Vi抗原能夠有效保護(hù)菌體在感染機(jī)體中生存下來(lái)。腸道中該抗原能夠抵抗腸道的高滲微環(huán)境；在血液中通過(guò)Vi抗原的血清抗性避免補(bǔ)體系統(tǒng)的溶解作用；還能抵抗宿主吞噬細(xì)胞的吞噬作用[9]。Vi抗原在保護(hù)菌體免受宿主不同免疫機(jī)制的清除作用中發(fā)揮著重要作用。進(jìn)一步的研究認(rèn)為，沙門(mén)菌毒力因子在細(xì)菌的入侵、繁殖、擴(kuò)散、致病、毒性等方面發(fā)揮著至關(guān)作用[10]。沙門(mén)菌毒力因子由染色體上毒力島SPI、染色體上非SPI毒力因子和質(zhì)粒毒力因子組成。而沙門(mén)菌所包含的19個(gè)毒力島中就有85個(gè)毒力基因。對(duì)毒力基因的深入研究將有助于掌握沙門(mén)菌的進(jìn)化規(guī)律，在闡述致病機(jī)理、評(píng)估致病風(fēng)險(xiǎn)等方面有重要意義。有研究認(rèn)為，自噬現(xiàn)象在沙門(mén)菌感染中適度激活有利于清除胞內(nèi)感染病原菌、減輕細(xì)胞損傷,沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spvB通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬水平來(lái)控制感染性疾病[11]。

2 檢測(cè)方法

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定 傳統(tǒng)培養(yǎng)法是將采集的標(biāo)本接種于適于細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上，提供其生長(zhǎng)所必須的條件，如適宜溫度、濕度、氣體環(huán)境等，符合特定條件的細(xì)菌就會(huì)生長(zhǎng)繁殖長(zhǎng)出菌落。鑒定方法則一般采用生化試驗(yàn)和血清學(xué)分型，因不同種類的細(xì)菌對(duì)生化試驗(yàn)有著不同的反應(yīng)，因此根據(jù)試驗(yàn)反應(yīng)性的差異判斷其歸屬哪類細(xì)菌。該法的局限性在于手工操作復(fù)雜、技術(shù)要求嚴(yán)格、培養(yǎng)較為費(fèi)時(shí)，多數(shù)細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定檢測(cè)周期需要花費(fèi)約4 d的時(shí)間，生長(zhǎng)緩慢的菌落所耗費(fèi)的時(shí)間甚至更長(zhǎng)。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)與鑒定多采用該傳統(tǒng)方法進(jìn)行檢測(cè)，這類方法也是沙門(mén)菌檢驗(yàn)的基準(zhǔn)方法。各地區(qū)采用該法較為普遍的原因在于檢測(cè)成本相對(duì)低，準(zhǔn)確性較好。在沙門(mén)菌培養(yǎng)基中加入某些特異性酶底物，當(dāng)有特異性酶作用時(shí)可呈現(xiàn)顏色變化，對(duì)于可疑沙門(mén)菌則更易識(shí)別[12]。這種顯色培養(yǎng)法使用起來(lái)更為方便，且操作簡(jiǎn)單，可大大縮短檢測(cè)時(shí)間，還能減少假陽(yáng)性菌所產(chǎn)生的可疑菌落，簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程，可節(jié)省一定的人力和物力。目前顯色培養(yǎng)法多用于研究領(lǐng)域中，由于成本較普通培養(yǎng)成本高，適合食品及突發(fā)公共衛(wèi)生事件的快速檢測(cè)[13]。

2.2 免疫學(xué)檢測(cè)法 沙門(mén)菌免疫學(xué)檢測(cè)方法大致可分為：膠乳凝集法、膠體金試紙法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫層析法(Dot-ELISA)、免疫磁珠分離法等[14]。這些方法的原理是對(duì)檢測(cè)標(biāo)本中特異性抗原或抗體進(jìn)行檢測(cè)。免疫學(xué)檢測(cè)方法優(yōu)點(diǎn)在于不需要對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)及純化步驟，檢測(cè)流程較為方便。免疫法中膠體金試紙法使用起來(lái)方便，快捷，但敏感性一般；ELISA相對(duì)金標(biāo)試紙條敏感性有所增加，所需時(shí)間較后者長(zhǎng)，對(duì)人員素質(zhì)和設(shè)備要求相對(duì)高一些。免疫磁珠分離技術(shù)是利用磁珠上包被的特異性抗體與抗原發(fā)生反應(yīng)，將目標(biāo)抗原分離。該法靈敏度高，可將檢測(cè)時(shí)間縮短至幾個(gè)小時(shí)，在食源性致病菌檢測(cè)中有較好的應(yīng)用前景[15]。

2.3 分子生物學(xué)檢測(cè) 隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的快速發(fā)展，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用和肯定。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)、核酸探針技術(shù)、基因芯片技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、熒光定量PCR等技術(shù)均可應(yīng)用于沙門(mén)菌檢測(cè)，檢測(cè)方法的日益更新已經(jīng)實(shí)現(xiàn)高通量低成本，快速精準(zhǔn)的檢測(cè)。PCR法檢測(cè)沙門(mén)菌的原理是對(duì)特定靶基因引物在適宜條件下進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)檢測(cè)核算產(chǎn)物確定菌種。通常將沙門(mén)菌種屬特異性基因作為靶基因，設(shè)計(jì)出特異性引物。該法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高，測(cè)定速度快等優(yōu)點(diǎn)[16]。多重PCR與傳統(tǒng)生化學(xué)測(cè)定、血清分型在鼠傷寒沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌、雞沙門(mén)氏菌和雞白痢沙門(mén)氏菌的對(duì)比研究顯示，該法在鑒別和區(qū)分沙門(mén)氏菌血清型中被認(rèn)為是簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的。食品衛(wèi)生沙門(mén)菌檢驗(yàn)中采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)已經(jīng)證實(shí)有較好的敏感性和特異性，并且操作過(guò)程簡(jiǎn)單，能夠大大縮短檢測(cè)時(shí)間，在食品衛(wèi)生檢測(cè)中有更高的應(yīng)用價(jià)值，但是該法對(duì)引物設(shè)計(jì)要求較高，這也是LAMP技術(shù)能否成功的關(guān)鍵因素[17]。

2.4 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS) MALDI-TOF MS是近年來(lái)出現(xiàn)的一類質(zhì)譜技術(shù)，該法對(duì)微生物中特異性核糖體蛋白進(jìn)行軟電離，隨后將形成的特異性蛋白指紋圖譜與現(xiàn)有的各類微生物的蛋白指紋圖譜庫(kù)進(jìn)行匹配，以確定目標(biāo)菌的種類。該法圖譜庫(kù)資源豐富，可用于常規(guī)條件下難以鑒定的細(xì)菌。梁達(dá)煒等[18]研究顯示，無(wú)論在以上何種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)菌，MALDI-TOF MS法均能準(zhǔn)確鑒定到沙門(mén)菌菌屬，足以滿足臨床對(duì)沙門(mén)菌的檢測(cè)需求。經(jīng)核算MALDI-TOF MS的耗材成本較Vitek2法低3倍，其花費(fèi)的檢測(cè)時(shí)間卻僅僅為Vitek2所用時(shí)間的1/7，解決了傳統(tǒng)微生物鑒定中耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)[19]。MALDI-TOF MS配合Strain Solution? ver.2蛋白分型軟件在血清型水平發(fā)揮著精確和詳細(xì)辨析微生物的極大潛力，優(yōu)越性超出常規(guī)的指紋圖譜方法，Ojima-Kato等[20]用MALDI-TOF MS檢測(cè)了患者和食品中的共116株來(lái)自23種不同血清型的沙門(mén)氏菌，結(jié)果該法在臨床及食品安全領(lǐng)域能夠快速、精確地做到微生物血清水平分型檢測(cè)。

3 總結(jié)

隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，沙門(mén)菌研究提升至分子及基因?qū)用?，致病機(jī)理的揭示能夠幫助人們了解疾病的發(fā)展及演變過(guò)程。檢測(cè)手段的發(fā)展及更新有助于及時(shí)、快速、準(zhǔn)確地明確診斷疾病，為采取治療節(jié)省寶貴時(shí)間。當(dāng)然，了解了沙門(mén)菌的傳播途徑和入侵機(jī)理對(duì)于提前采取預(yù)防措施顯得更加重要。為此，一方面要注重食品安全，控制攜帶或感染沙門(mén)氏菌的病畜及肉類流入市場(chǎng)，同時(shí)加強(qiáng)豬肉、禽肉、蛋制品的衛(wèi)生監(jiān)管，通過(guò)切斷沙門(mén)菌傳播途徑，防止沙門(mén)菌的擴(kuò)散傳播；另一方面，繼續(xù)開(kāi)發(fā)和研究新型疫苗是預(yù)防和控制沙門(mén)氏菌的重要措施。目前，減毒沙門(mén)菌活載體在病毒疫苗、細(xì)菌疫苗、寄生蟲(chóng)疫苗及腫瘤疫苗的應(yīng)用研究表現(xiàn)出很好的廣闊前景，該法正在得到廣泛的研究和討論。在腫瘤研究領(lǐng)域，具有良好的侵襲性和專一趨向性的減毒沙門(mén)菌活載體，將攜帶功能性質(zhì)粒可從接種部位積聚于腫瘤部位，并且在腫瘤部位通過(guò)選擇性復(fù)制效應(yīng)阻礙腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，繼而可能激活腫瘤細(xì)胞的“自殺”或凋亡。