骨質(zhì)疏松癥發(fā)病相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的研究進(jìn)展

李曉宇 費(fèi)琦 林吉生 于凌佳 楊雍 李東 李錦軍 孟海

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院骨科，北京 100050

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見的全身性骨骼疾病，導(dǎo)致骨骼脆性改變和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。隨著我國老齡化社會(huì)的到來，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥已成為面臨的重要健康問題。骨質(zhì)疏松癥是一種復(fù)雜的疾病，受環(huán)境因素和遺傳因素影響[1]。OP的易感性由多種遺傳變異及其與飲食運(yùn)動(dòng)等環(huán)境因素之間的相互作用而決定。骨質(zhì)疏松的遺傳率估計(jì)為50%～85%，提示遺傳因素在OP發(fā)病中的重要性[2]。鑒定OP相關(guān)基因，并明確其致病機(jī)制，對(duì)于OP的預(yù)防和治療意義重大。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding，lncRNA)是近年來研究的熱點(diǎn)，它是一種長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的無或很少編碼蛋白質(zhì)的RNA，雖然一段時(shí)間人們認(rèn)為lncRNA只是轉(zhuǎn)錄中的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)作用。但是近年來，很多的研究證實(shí)lncRNA具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，與人類疾病的發(fā)生有密切的聯(lián)系。lncRNA可以在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳學(xué)水平上調(diào)節(jié)靶基因，參與包括骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的疾病的發(fā)生[1-2]。自從Morrison于1992年發(fā)現(xiàn)維生素D受體基因型與骨密度關(guān)系密切以來，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近100種骨質(zhì)疏松相關(guān)基因，主要包括以下4個(gè)方面：(1)鈣離子相關(guān)激素及受體；(2)成骨細(xì)胞；(3)破骨細(xì)胞；(4)其他方面。骨質(zhì)疏松相關(guān)的基因研究是目前研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)，其發(fā)病的分子機(jī)制了解還十分有限，這已成為骨質(zhì)疏松癥的臨床治療與基礎(chǔ)研究的瓶頸?；蛘{(diào)控位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及其對(duì)骨密度變異的生物學(xué)功能的闡明，對(duì)于了解骨質(zhì)疏松癥的病因，開發(fā)新的骨質(zhì)疏松癥篩查、預(yù)防和治療方法具有重要意義。本文就lncRNA在骨質(zhì)疏松方面的研究進(jìn)展展開綜述，探討其研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景。

1 LncRNA與骨質(zhì)疏松

大約70%的人類基因組能夠被轉(zhuǎn)錄，而其中僅有1%～2%能夠編碼蛋白，余下98%均為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)。ncRNA在很長(zhǎng)一段時(shí)間里都被認(rèn)為轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物。直到1990年，Richard Jorgensen在對(duì)牽?；ㄗ龌蚋脑鞎r(shí)發(fā)現(xiàn)添加的DNA序列會(huì)影響內(nèi)源性基因的表達(dá)，RNA干擾(RNAi)的首次發(fā)現(xiàn)才引起研究者對(duì)ncRNA功能的關(guān)注。根據(jù)核苷酸序列的長(zhǎng)度，ncRNA可分為短鏈ncRNA(short/small ncRNA)和長(zhǎng)鏈lncRNA(long ncRNA)，一般將長(zhǎng)度大于200核苷酸ncRNA定義為lncRNA。lncRNA雖然不編碼蛋白質(zhì)，但通過反式和順式兩種方式在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用[3]，可以在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳學(xué)水平上調(diào)節(jié)靶基因，與包括癌癥和骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的疾病有關(guān)[4]。lncRNA在細(xì)胞核內(nèi)和胞質(zhì)中可以通過各種機(jī)制調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在細(xì)胞核內(nèi)主要通過參與表觀遺傳調(diào)控、參與轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、對(duì)胞核核體結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)節(jié)[5-7]。lncRNA可以在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳學(xué)水平上調(diào)節(jié)目標(biāo)基因，目前發(fā)現(xiàn)其與mRNA、miRNA、蛋白均存在互作機(jī)制，包括OP在內(nèi)的多種疾病中都有l(wèi)ncRNA調(diào)控涉及，有望成為疾病診斷與預(yù)測(cè)的生物學(xué)指標(biāo)[4]。人體的骨代謝是維持一種“骨生成與骨凋亡”的平衡狀態(tài)，維持這種平衡需要一系列信號(hào)通路共同參與調(diào)控，包括cAMP、CaMK、MEG3、DEPTOR、MAPK等[8-9]，lncRNA在這個(gè)過程中扮演了重要的角色。

lncRNA是骨質(zhì)疏松癥病理生理過程的重要調(diào)控因子，現(xiàn)有的研究已經(jīng)證實(shí)骨質(zhì)疏松和骨密度具有遺傳性，已有超過60個(gè)易感位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)與骨質(zhì)疏松和BMD有關(guān)[10-11]。已發(fā)現(xiàn)lncRNA-H19、TIST和MEG3均被發(fā)現(xiàn)涉及骨質(zhì)疏松相關(guān)的成骨細(xì)胞分化，凋亡過程[12-14]。Fei 等[15]通過高通量RNA測(cè)序鑒定了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者和正常對(duì)照患者血液樣本的lncRNA和mRNA表達(dá)，共獲得185個(gè)顯著的差異表達(dá)mRNAs和51個(gè)顯著的差異表達(dá)lncRNA。這也是首次通過RNA測(cè)序得到絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的lncRNA表達(dá)，并構(gòu)建出了差異表達(dá)的mRNA與差異表達(dá)的lncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。Jin等[16]研究了骨質(zhì)疏松患者外周血淋巴細(xì)胞中的LncRNA表達(dá)，共發(fā)現(xiàn)了70個(gè)顯著表達(dá)的LncRNA，其中上調(diào)LncRNA39個(gè)，下調(diào)LncRNA 31個(gè)。陳娟等[17]對(duì)比了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥6例和健康絕經(jīng)后婦女3例的lncRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)了8條lncRNAs 可能通過調(diào)控 Jak/STAT、MAPK、胰島素通路和鈣離子代謝等信號(hào)通路參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展過程。Zhang等[18]采用人全轉(zhuǎn)錄組芯片對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的差異編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜及功能網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)行了研究，在成骨分化過程中，共檢測(cè)到1 408個(gè)差異表達(dá)的LncRNA，其中785個(gè)顯著上調(diào)，623個(gè)顯著下調(diào)。Zuo等[19]發(fā)現(xiàn)在間充質(zhì)干細(xì)胞早期成骨分化過程中，LncRNA表達(dá)不同，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間存在116個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，提示了LncRNA可能在成骨細(xì)胞分化中發(fā)揮某些作用。目前的研究提示了lncRNA可能參與調(diào)解骨質(zhì)疏松的發(fā)病過程，但是多數(shù)的研究只停留在轉(zhuǎn)錄組的初步篩選，并未涉及更加深入的研究，有待更加深入的考證。

2 LncRNA與鈣離子

鈣是人體內(nèi)的重要物質(zhì)元素，人體99%以上的鈣離子分布于骨組織中，因此鈣離子是研究骨質(zhì)疏松不可或缺的一項(xiàng)重要因素。除構(gòu)成骨以外，鈣離子還可以通過激活多種細(xì)胞外信號(hào)通路參與骨形成，如環(huán)單磷酸腺苷(cAMP)、鈣調(diào)蛋白激酶II(CaMK II)和多種鈣離子依賴蛋白等。lncRNA可以通過調(diào)節(jié)與鈣相關(guān)信號(hào)而參與骨代謝相關(guān)細(xì)胞的增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、凋亡等各個(gè)生理病理過程。Mccoy等[20]在研究一種疫苗佐劑過程中發(fā)現(xiàn)，lncRNA A_30_P01018532與炎癥免疫相關(guān)，上調(diào)其表達(dá)可以顯著提高細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平。Hadji等[21]觀察到lncRNA H19在主動(dòng)脈鈣化患者中存在高表達(dá)，通過基因組分析，發(fā)現(xiàn)了lncRNA H19可以通過調(diào)節(jié)Notch1啟動(dòng)子的甲基化程度，下調(diào)2個(gè)下游基因表達(dá)Runx2 和BMP2，從而誘導(dǎo)成骨表達(dá)。此外，lncRNA H19基因控制印跡基因網(wǎng)絡(luò)(IGN)中胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF2)的表達(dá)，在胚胎發(fā)育和個(gè)體生長(zhǎng)過程中有重要作用。Huang等[23]在研究鼻咽癌的發(fā)病誘因過程中發(fā)現(xiàn)lncRNA FOXD3被沉默后可以增加細(xì)胞的鈣離子濃度。由于骨質(zhì)疏松與鈣離子水平密切相關(guān)，且目前有關(guān)lncRNA調(diào)解鈣離子文獻(xiàn)較少，細(xì)胞游離鈣水平是否影響骨質(zhì)疏松發(fā)病有待進(jìn)一步研究。

3 LncRNA與成骨細(xì)胞

成骨細(xì)胞在骨形成過程中要經(jīng)歷成骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟、細(xì)胞外基質(zhì)礦化和成骨細(xì)胞凋亡4個(gè)階段，而lncRNA在其中扮演了重要的角色。Pei等[23]在對(duì)小鼠LncRNA的研究中發(fā)現(xiàn)了lncRNA參與成骨細(xì)胞的分化過程，提示LncRNA在成骨細(xì)胞分化中扮演著重要的角色。Chen等[8]采用卵巢切除小鼠模型分別在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)成骨，探討了DEPTOR(DEP domain containing mTOR interacting protein)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的關(guān)系并對(duì)其lncRNA和mRNA序列進(jìn)行了研究。最終揭示了DEPTOR參與骨質(zhì)疏松的發(fā)病，并且在骨質(zhì)疏松骨中有較高的表達(dá)。Xu等[24]發(fā)現(xiàn)LncRNA HIF1α-AS1(hypoxia-inducible factor 1α-anti-sense 1)不僅可以調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖凋亡過程，還是成骨細(xì)胞分化過程的重要中介，可能有助于研發(fā)骨質(zhì)疏松癥的基因療法。Gao等[25]發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1)在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中增加了成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-143抑制miR-143的表達(dá)，從而導(dǎo)致成骨分化。但是，LncRNA MALAT1在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化和骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用尚不清楚。Wang等[26]研究了lncRNA MEG3在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中的功能，發(fā)現(xiàn)了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中MEG3和miR-133a-3p的表達(dá)明顯增加，而MEG3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了成骨誘導(dǎo)下調(diào)miR-133a-3p的過程，同時(shí)SLC39A1表達(dá)顯著下降，最終導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的PMOP成骨分化受到抑制，進(jìn)而促進(jìn)了骨質(zhì)疏松的發(fā)生。Peng 等[27]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的基因表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)LncRNA NTF3-5可以通過下調(diào)miR-93-3p促進(jìn)成骨分化和骨再生。Jin等[28]發(fā)現(xiàn)LncRNA MIAT的下調(diào)可以增強(qiáng)人脂肪源性干細(xì)胞(hASCs)的成骨分化，首次揭示了MIAT在hASCs成骨分化中的表達(dá)譜，為骨組織工程提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。LncRNA-H19最初被認(rèn)為是一種成骨促進(jìn)劑，Huang等[29]發(fā)現(xiàn)LncRNA-H19在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中，存在著明顯的表達(dá)上調(diào)，可以促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的增殖，LncRNA-H19過表達(dá)誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化，促進(jìn)體內(nèi)異位骨形成。Bu等[30]探討了LncRNA TSIX/miR-30a-5p軸在顆粒誘導(dǎo)骨溶解中的作用，發(fā)現(xiàn)TSIX負(fù)調(diào)控miR-30a-5p的表達(dá)，而miR-30a-5p可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞在體內(nèi)和體外的凋亡。Linc-ROR是一個(gè)2.6 kb的LncRNA，是多能干細(xì)胞重編程的關(guān)鍵調(diào)控因子，其上調(diào)與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化有關(guān)，LncRNALincROR的下調(diào)可以阻斷人骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[31]。

通過對(duì)LncRNA在成骨分化中的作用機(jī)制研究，探究細(xì)胞分子信號(hào)通路，有望從基因角度調(diào)節(jié)細(xì)胞分化方向，提高成骨分化效率，對(duì)骨質(zhì)疏松的治療以及骨組織工程學(xué)的臨床應(yīng)用意義重大。

4 LncRNA與破骨細(xì)胞

破骨細(xì)胞來源于造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSCs)中的單核巨噬細(xì)胞系分化而來，其主要功能為局部泌酸以及釋放骨基質(zhì)降解酶完成骨的吸收和降解從而維持骨穩(wěn)態(tài)。在破骨細(xì)胞相關(guān)的研究中，尤其是LncRNA在破骨細(xì)胞分化、融合、功能的研究非常缺乏。隨著LncRNA的研究不斷深入，越來越多的學(xué)者也開始關(guān)注lncRNA在破骨細(xì)胞中的調(diào)節(jié)機(jī)制。竇策等[32]首次報(bào)道了破骨細(xì)胞形成過程中l(wèi)ncRNA、mRNA、circRNA以及miRNA的表達(dá)譜，為探索破骨細(xì)胞分化機(jī)制提供了借鑒。Tong等[33]通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)低BMD患者的骨單核細(xì)胞內(nèi)LncRNA DANCR存在顯著的上調(diào)，提示LncRNA DANCR可以誘導(dǎo)骨單核細(xì)胞中IL6和TNF-a的表達(dá)，影響破骨細(xì)胞骨重塑過程。LncRNA DANCR參與骨質(zhì)疏松癥的病理學(xué)，可能成為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的生物標(biāo)志物。Lee等[34]通過對(duì)破骨細(xì)胞分化過程中LncRNA和mRNA的分期特異性表達(dá)進(jìn)行了分析后發(fā)現(xiàn)，LncRNA-jak3可以通過促進(jìn)破骨細(xì)胞因子Nfatc1(nuclear factor of activated T-cells 1)的表達(dá)，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，證實(shí)LncRNA-jak3通過jak3/Nfatc1/Ctsk軸在破骨細(xì)胞分化中起著關(guān)鍵的功能。Chuan等[35]通過qPCR驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)Lnc-AK077216在骨形成過程中存在高表達(dá)，可抑制NIP45表達(dá)，促進(jìn)NFATc1的表達(dá)，而NFATc1是破骨細(xì)胞生成過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)控破骨細(xì)胞的形成。

到目前為止，有關(guān)破骨細(xì)胞相關(guān)的lncRNA研究仍十分有限，缺乏其深入的研究。精確調(diào)控破骨細(xì)胞分化的各個(gè)階段，對(duì)臨床上治療骨質(zhì)疏松及破骨細(xì)胞相關(guān)疾病具有重要意義。

5 總結(jié)與展望

LncRNA日益被公認(rèn)是具有眾多生物功能的關(guān)鍵調(diào)控分子。自LncRNA在哺乳動(dòng)物中首次被證實(shí)存在以來，LncRNA的研究成為了目前研究的熱點(diǎn)，有關(guān)LncRNA的生物功能被不斷的發(fā)現(xiàn)也取得了重大的進(jìn)展。盡管骨質(zhì)疏松與LncRNA的生物學(xué)相關(guān)性被不斷報(bào)道，但是目前的研究還多局限于轉(zhuǎn)錄組的研究，有關(guān)骨質(zhì)疏松發(fā)病的確切的機(jī)制仍未完全了解。隨著科學(xué)的不斷進(jìn)步，未來的骨質(zhì)疏松癥的治療方案將有望提升到基因水平，可能通過操縱LncRNA表達(dá)水平來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的生物學(xué)功能。目前有關(guān)骨質(zhì)疏松相關(guān)的LncRNA研究還很有限，LncRNA的深入研究不僅有助于了解骨質(zhì)疏松癥的分子生物學(xué)機(jī)制、提供新的生物學(xué)標(biāo)志物，也對(duì)疾病的診斷、治療及預(yù)后提供新的方式和手段。