慢性傷口細菌生物膜的研究進展

程海濤，黃桂玲

（1.長江大學醫(yī)學院，湖北430000；2.武漢大學中南醫(yī)院）

慢性傷口是指經(jīng)過臨床治療6 個月后，完全沒有愈合跡象的傷口。壓瘡、糖尿病足潰瘍、動靜脈潰瘍、創(chuàng)傷性潰瘍、腫瘤傷口等是慢性傷口的典型代表[1],目前臨床上常采用的手段主要有手術(shù)清創(chuàng)、自溶性清創(chuàng)，同時輔以局部負壓真空吸引、高壓氧等治療[2]。2014版臨床實踐指南提出：細菌生物膜（BBF）的評估和治療是慢性傷口研究領(lǐng)域的最新前沿。其作為細菌、細胞分泌的產(chǎn)物和分泌的細胞外基質(zhì)以及壞死的碎片等混合成的一種膜性組織[3]，對慢性傷口治療以及護理具有重要影響?，F(xiàn)將慢性傷口的細菌生物膜形成機制、特點、去除方法以及慢性傷口愈合過程中參與的相關(guān)因子綜述如下。

1 細菌生物膜形成機制

細菌生物膜形成機制主要包括3 方面：①在嚴重營養(yǎng)不良、超低酸堿度（pH）以及極高滲透壓因素下，浮游細菌通過黏附因子黏附在創(chuàng)面[4]。②抗生素濫用導(dǎo)致耐藥細菌大量繁殖擴張，形成生物膜[5]。③群體感應(yīng)(QS)機制，包括QS 分子作用和對上皮細胞的刺激。QS 分子方面，QS 分子誘導(dǎo)機體感染的中性粒細胞或者巨噬細胞凋亡，以凋亡細胞為食，通過中性粒細胞或者巨噬細胞凋亡后的氧化酶和降解酶破壞機體，造成生物膜中的細菌大面積擴散，銅綠假單胞菌的高絲氨酸內(nèi)酯信號分子（AHL）和假單胞菌喹諾酮信號（PQS）對巨噬細胞激活作用下降，機體免疫向Th2 型發(fā)展，導(dǎo)致創(chuàng)面炎癥狀態(tài)不能轉(zhuǎn)歸，傷口遷延不愈[6]。上皮細胞的刺激作用方面，金黃色葡萄球菌生物膜會導(dǎo)致上皮角化細胞凋亡并限制其生長。α-毒素作為金黃色葡萄球菌形成生物膜的關(guān)鍵物質(zhì)，會通過對上皮角化細胞的誘導(dǎo)，導(dǎo)致細胞毒性反應(yīng)，最終迫使其凋亡。一般情況下，當感染傷口只有浮游菌時，角化細胞首先會細菌內(nèi)化，然后會迫使其凋亡，而在生物膜中，不需要經(jīng)歷內(nèi)化過程，而是可以直接誘導(dǎo)其凋亡，這就會造成細菌大面積繁殖，覆蓋慢性傷口表面，最終延遲傷口愈合。生物膜組成成分能夠限制中性粒細胞趨化和分泌，并且會迫使成纖維細胞提前衰老，從而降低機體免疫功能以及阻礙成纖維細胞重建最終導(dǎo)致傷口不愈合?？梢姡斐蓜?chuàng)面不愈合的機制是在特殊細菌的細胞學基礎(chǔ)之上的相對性的研究機制，主要細菌是銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌；主要參與細胞是中性粒細胞以及巨噬細胞、上皮角化細胞以及成纖維細胞。

2 慢性傷口細菌生物膜的特點

①細菌生物膜廣泛存在于慢性傷口，且不宜檢出。慢性傷口必然有細菌黏附，開放性傷口2 d 不清創(chuàng)，皮膚周圍的細菌就會導(dǎo)致創(chuàng)面污染[7]，加之其以生物膜作為天然“避風港”，以往檢測不能突破生物膜屏障，導(dǎo)致感染細菌的種類很難被檢測出。為此，越來越多的研究人員開始探索、使用新穎、高效的檢測手段，如聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）、激光共聚焦掃描技術(shù)（CLSM）、熒光原位雜交技術(shù)（FISH）以及分子檢測技術(shù)等[8]。②細菌生物膜難以被清除，再生能力很強。其原因主要是：其一，細菌以附著于傷口表面為生，并以創(chuàng)面為營養(yǎng)來源；其二，細菌通過與細胞外基質(zhì)混合、處于休眠狀態(tài)的方式形成抵抗抗菌藥物作用的防御屏障，致使普通抗菌藥物不能有效殺滅細菌[9-10]。

3 慢性傷口細菌生物膜去除方法

3.1 物理機械清創(chuàng)方法 有效清除細菌生物膜的第1 步是徹底、有效的手術(shù)清創(chuàng)[11]，即用手術(shù)刀清除異物和愈合不良組織，暴露干凈創(chuàng)面，切除已經(jīng)失活的組織、腐肉以及壞死組織，甚至一些竇道，讓傷口徹底變?yōu)樾迈r傷口，保留組織活性[12]。清創(chuàng)不及時以及細菌生物膜殘留都會引起多菌種細菌定植，導(dǎo)致二次感染，影響愈合[13]。水刀（超聲霧化水流技術(shù)）的核心技術(shù)是液體噴射，高速霧化水流可快速清除細菌生物膜，創(chuàng)面環(huán)境濕潤潔凈，病人感受良好，屬于無痛清創(chuàng)。Caputo等[14]采用水刀無痛清創(chuàng)對潰瘍病人實施治療，結(jié)果顯示：超聲霧化水流技術(shù)高效、安全、操作簡單、快速，其與手術(shù)清創(chuàng)比較，清創(chuàng)花費時間較短，手術(shù)速度較快，并且耗材量較少，舒適度較好。

3.2 封閉負壓引流技術(shù) 程海濤等[15]對于慢性傷口的治療方法進行研究，結(jié)果顯示：封閉負壓引流技術(shù)聯(lián)合濕性愈合與常規(guī)換藥以及傳統(tǒng)濕性愈合比較，病人傷口愈合比例較高，創(chuàng)面修復(fù)較快，滲液pH 值較低，換藥次數(shù)及醫(yī)療花費較少。原因可能是封閉的濕潤環(huán)境適合傷口愈合，也利于肉芽組織生長；同時，在封閉環(huán)境下及早運用封閉負壓引流，可以保持創(chuàng)面清潔，避免細菌感染；此外，負壓狀態(tài)下及時進行流水沖洗和抽吸，可以及時清除傷口滲出液及壞死組織，細菌繁殖失去有利條件，有利于傷口快速愈合。封閉負壓引流技術(shù)一方面為慢性傷口治療提供了有效選擇，另一方面也存在一定弊端，如可能導(dǎo)致肉芽組織過度增生，病人瘢痕情況較明顯。隨著醫(yī)療水平不斷提高以及材料學發(fā)展，封閉負壓引流技術(shù)逐漸被應(yīng)用于大部分急診創(chuàng)傷以及部分難愈性傷口，在復(fù)雜的環(huán)境下，醫(yī)務(wù)人員還應(yīng)進行針對性的抗感染治療，注意不能過度使用抗感染藥物，以防發(fā)生耐藥性風險。

3.3 化學藥物預(yù)防

3.3.1 抗生素 不恰當?shù)氖褂每股貢偈辜毦锬ば纬蒣16]；同時，慢性傷口細菌生物膜形成后，其對抗菌藥物的防滲透會限制抗菌藥物與細菌大面積接觸，從而使藥效只能發(fā)揮65%～70%，造成細菌耐藥性提高上千倍[17]。故臨床治療感染時應(yīng)綜合考慮以選擇最優(yōu)抗生素。清除生物膜作用效果較好的抗生素分別是氟喹諾酮類、亞胺培南；對細菌細胞外多糖基質(zhì)滲透較好的是大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類、頭孢他啶、氨基糖甙類[18]。多菌種導(dǎo)致的細菌生物膜治療方案以聯(lián)合用藥為主，如頭孢類用藥搭配克拉霉素可直接破壞細菌生物膜，用藥3 d 后可殺死金黃色葡萄球菌，預(yù)防感染[19]。

3.3.2 含銀敷料 含銀敷料是去除細菌生物膜，促進慢性傷口愈合過程中首推的廣譜抗菌敷料，高濃度銀離子敷料（5～10 g/mL)作用于傷口1～2 d，細菌生物膜內(nèi)的細菌會被基本殺死[20]，可能是由于銀離子不僅可以將細菌和氧氣、養(yǎng)分隔絕，阻止代謝毒素釋放，還可以局部抗感染，降低創(chuàng)面中細菌的擴展水平，加速傷口愈合[21]。含銀敷料材質(zhì)具有彈性，故有效固定于創(chuàng)面尤為重要。

3.3.3 碘 碘可以有效殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，但其直接作用于傷口會有細胞毒性且可能造成病人不舒適[22]。

3.4 生物療法 蛆蟲療法(MDT)是在傷口處放無菌醫(yī)用蛆蟲，利用其生物功能，消化、吸收壞死組織碎片和腐肉，從而去除細菌賴以生存的基床，搶奪細菌營養(yǎng)源，減緩細菌繁殖速度，減輕炎癥反應(yīng)，進而使傷口通過自身免疫愈合[23]。蛆蟲只消化、吸收腐肉，對正常細胞無危害；同時，它還可以爬至傷口深部竇道蠶食細菌生物膜最易形成的部位；此外，蛆蟲可分泌多種蛋白酶以及抗菌酞，分泌物能將腐肉分解成半液狀，加快蛆蟲第2 輪蠶食，最終殺滅、降解細菌[24]。極具創(chuàng)意的蛆蟲清除生物膜的方案，必須深挖其機制研究，以更好地指導(dǎo)臨床[25]。

3.5 其他 2000 多年前蜂蜜就開始用于覆蓋、治療潰爛傷口，研究顯示：蜂蜜可殺死大部分細菌，如革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、需氧菌、厭氧菌等，其療效顯著，愈合速度較快[26]。無菌蜂蜜去除細菌生物膜可能是由于其高糖、高滲透力可以直接突破生物膜屏障[27]。值得注意的是，蜂蜜可以滅菌，并不意味著任何蜜蜂采的蜂蜜效果均顯著，一般深山地區(qū)較好，這可能與所采蜜內(nèi)含有植物素有關(guān)。隨著醫(yī)學研究的不斷深入，植物素滅菌也成為人們關(guān)注的焦點[28]。

4 慢性傷口愈合過程中涉及的因子

慢性傷口細菌生物膜被去除后，各種炎性因子會在傷口處呈現(xiàn)高表達，免疫應(yīng)答一旦被激活，創(chuàng)面即可快速愈合。

4.1 Toll 受體（TLR） TLR 作為對抗抗原和自身異常的候選基因[29]，可以快速識別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)[30]，其高表達可快速識別細菌感染，激活天然免疫反應(yīng)，促進傷口愈合。其中，TLR 家族中的TLR2專門識別革蘭陽性菌成分和細菌脂蛋白脂胞壁酸，其與TLR6 混合共同識別革蘭陰性菌成分、酵母多糖、肽聚糖、支原體脂蛋白；TLR4 是機體對脂多糖(Lipopolysaccharide-LPS)應(yīng)答(革蘭陰性菌)的關(guān)鍵受體[31-32]。此外，TLR 高表達也可激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB[33]，刺激與免疫相關(guān)的因子，引起明顯的炎癥反應(yīng)，尤其是腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)促炎細胞因子是炎癥反應(yīng)表達最高的因子。

4.2 巨噬細胞移動抑制因子(MIF) MIF 是炎癥介質(zhì)，被各種系統(tǒng)和組織中的細胞廣泛表達。丘腦-垂體軸調(diào)節(jié)MIF 分泌，糖皮質(zhì)激素也可控制其釋放水平以及合成數(shù)量[34]。研究表明：MIF 是促炎因子，是先天免疫和后天免疫的重要調(diào)節(jié)因子，其可以通過促進炎癥因子產(chǎn)生和負性調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素的抗炎作用來影響機體免疫反應(yīng)[35]。MIF 分泌增加可誘導(dǎo)巨噬細胞分泌其他促炎因子，并以自分泌和旁分泌方式激活T 淋巴細胞，從而加劇炎癥反應(yīng)；同時，MIF 也可抑制與糖皮質(zhì)激素相關(guān)的抗炎和免疫反應(yīng)，進而加重炎癥反應(yīng)。

4.3 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) VEGF 是一種可調(diào)節(jié)生成新生血管的糖基化分泌性多肽[36]，主要功能是促進內(nèi)皮細胞增生、趨化細胞移動以及增加血管通透性、誘導(dǎo)血漿蛋白溶酶原激活物和血漿溶酶原激活抑制劑-1 等從而改變細胞外基質(zhì)，使其更易于血管生長，其活性較強、專屬性較高，在促進內(nèi)皮細胞增殖、分裂和運動的同時，可增加血管通透性[37]。臨床可通過檢測VEGF 在創(chuàng)面的表達情況判斷創(chuàng)面愈合狀況，VEGF 轉(zhuǎn)錄和分泌在部分和全層皮膚傷口中提高，則說明創(chuàng)面正在愈合[38]。

4.4 表皮細胞生長因子（EGF） EGF 可通過信號傳導(dǎo)引起細胞內(nèi)生化反應(yīng)，啟停細胞分裂相關(guān)基因，使靜止細胞快速進入細胞分裂期，以達到細胞增殖的目的。首先，EGF 作為一種生長因子，具有對炎性細胞以及成纖維細胞和表皮細胞的選擇性以及迫使其趨向聚集的作用，它可以提高細胞遷移數(shù)量，迫使細胞朝創(chuàng)傷部位移動。其次，EGF 作為有絲分裂刺激源，可以加速細胞分裂，促進細胞增殖[39]。再次，EGF 還可以刺激細胞間質(zhì)快速合成，刺激血管快速生成，促使肉芽組織爬生，最終使創(chuàng)傷達到修復(fù)、愈合的狀態(tài)[40]。從機制來看，一方面，EGF 作為皮膚自帶物質(zhì)，通過多種、多層次磷酸化，可以實現(xiàn)細胞營養(yǎng)物質(zhì)增加的目的；另一方面，EGF 可通過活化糖酵解作用增強呼吸代謝頻率，它可激活磷酸果糖激酶，激活核糖核酸（RNA）轉(zhuǎn)錄，促進蛋白質(zhì)與脫氧核糖核酸（DNA）的合成，最終使表皮細胞增殖分化[41]。

4.5 成纖維細胞生長因子2（FGF2） FGF2 是多功能細胞生長因子，可以促進細胞間有關(guān)基質(zhì)蛋白的表達，促進內(nèi)皮細胞[42-43]、成纖維細胞的DNA 合成以及細胞分化、增殖，還可以重建新毛細血管結(jié)構(gòu)，加速傷口愈合[44-45]。同時，F(xiàn)GF2 也能增強炎性細胞殺菌能力，利于傷口的全面修復(fù)[46]。此外，F(xiàn)GF2 還可避免瘢痕形成。研究表明：創(chuàng)面愈合初期成纖維細胞數(shù)量會急劇增加，但隨著成纖維細胞達到峰值，F(xiàn)GF2 在傷口中的表達降低，敏感度下降，肉芽組織生長減慢[47]，過多的膠原降解，瘢痕形成減少。

5 小結(jié)

去除細菌生物膜是慢性傷口治療、護理研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容，本研究從細菌生物膜形成機制、特點、去除方法以及生物膜去除后傷口相關(guān)因子表達方面進行綜述，旨在為制定慢性傷口治療方案提供科學的理論依據(jù)。但本研究只介紹了目前使用頻率較多的與細菌生物膜相關(guān)的慢性傷口治療方案，基于臨床實踐的經(jīng)驗成果納入不足，研究者在以后研究中還需進一步擴大研究范圍，深化研究內(nèi)容。