與HCC相關(guān)的HBV T3098C突變的功能研究

陳忠信 郝澤坤 孫 一 虞亞菲 岳宗揚(yáng) 焦鳳萍

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 泰安 271016

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的基因突變與原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]，HBV的基因突變是HCC發(fā)生發(fā)展的重要病毒學(xué)因素，因此，篩選與HCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的HBV突變對HCC患者的診斷和預(yù)防有一定的臨床用途。

HBV為不完全閉合環(huán)狀雙鏈DNA，大小為3215 bp，其基因組雖小，但結(jié)構(gòu)十分精巧，包括有4個(gè)相互重疊的開放閱讀框、4個(gè)啟動(dòng)子和2個(gè)增強(qiáng)子[2]。HBV- T3098C突變正位于HBV基因組的Promotor II和preS1的重疊區(qū)域，并且可以使preS1蛋白的第84位氨基酸發(fā)生改變，使異亮氨酸(Ile)變?yōu)樘K氨酸(Thr)。在本研究中，我們檢測23例HCC患者癌組織中T3098C突變的情況，與患者的臨床資料進(jìn)行分析，尋找臨床相關(guān)性，并采用細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)來檢測T3098C突變對HBsAg合成和分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象 HCC患者術(shù)后病理檢查的殘余的癌組織。

1.1.2主要試劑 2×PCR反應(yīng)試劑盒、FastPfu高保真酶試劑盒、BioLabs的DpnI酶和TaKaRa的PrimeSTAR聚合酶均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白酶K溶液、DNA提取試劑盒(Axygen)、HBsAg時(shí)間分辨熒光檢測試劑盒、瓊脂糖等購自泰安華鵬試劑公司。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集 23例HCC患者術(shù)后病理檢查剩余的標(biāo)本，在-70℃冰箱冷凍保存。

1.2.2DNA提取和滾環(huán)擴(kuò)增HBV cccDNA 按照Axygen DNA試劑盒說明書的操作步驟提取癌組織的DNA，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性；采用PSAD酶消化非共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，滾環(huán)擴(kuò)增方法參照文獻(xiàn)。

1.2.3PCR擴(kuò)增HBV cccDNA的preS區(qū)并測序 PCR法擴(kuò)增HBV cccDNA的preS區(qū)，擴(kuò)增引物參見文獻(xiàn)[2]。瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物中目的條帶，送公司測序，測序結(jié)果采用DNAStar軟件進(jìn)行分析和比對，尋找HBV C基因型T3098C突變位點(diǎn)在23例HCC患者術(shù)后的癌組織中的存在情況。

1.2.4T3098C突變對HBsAg的影響 將Huh7和HepG2兩種肝癌細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，采用Lipo 2000轉(zhuǎn)染試劑，將HBV1.2×野生型質(zhì)粒和HBV1.2×- T3098C突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Huh7和HepG2細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)染后的第2、3、4天分別收集細(xì)胞和上清，細(xì)胞和上清中HBsAg的含量通過時(shí)間分辨熒光試劑盒進(jìn)行檢測。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用生存分析及Cox回歸分析法，取P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCC患者的臨床資料與癌組織中T3098C位點(diǎn)的突變情況

在23例HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌患者中，20例男性，3例女性，年齡的中位數(shù)是50歲，病理檢查的殘余組織來自于河南省腫瘤醫(yī)院住院患者(2009.07—2012.07)，患者的資料及T3098C突變檢測情況見表1。

表1 23例HCC患者的臨床資料及癌組織中T3098C位點(diǎn)的突變情況

2.2 T3098C突變位點(diǎn)的生存時(shí)間分析及Cox回歸分析

將HBV突變位點(diǎn)T3098和C3098進(jìn)行生存時(shí)間分析，發(fā)現(xiàn)攜帶T3098的肝癌患者生存時(shí)間短于攜帶C3098的肝癌患者(P<0.05)，見圖1，說明HBV- T3098C突變可能是肝癌患者的保護(hù)因素。并使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果見表2，表明T3098C突變是HCC患者術(shù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。

圖1 T3098C突變與患者術(shù)后生存時(shí)間的生存分析

表2 23例HCC患者采用Cox風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)測的結(jié)果

2.3 T3098C突變對HBsAg的影響

將HBV 1.2×質(zhì)粒和HBV 1.2×- T3098C突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Huh7和HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后第2、3、4天收集上清和細(xì)胞，時(shí)間分辨熒光法檢測HBsAg的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)T3098C突變型組細(xì)胞內(nèi)的HBsAg的含量低于HBV 1.2×野生型組(F=42.91，P<0.001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；T3098C突變型組上清和細(xì)胞內(nèi)總HBsAg的含量也低于HBV 1.2×野生型組(F=34.25，P<0.001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2，表明T3098C突變可能降低了HBsAg的合成，并可能促進(jìn)了HBsAg的外泌。

A.Huh7中細(xì)胞、上清和總HBsAg含量；B.HepG2中細(xì)胞、上清和總HBsAg含量。** 表示P<0.001。圖2 HBV- T3098C和野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7和HepG2細(xì)胞后檢測的HBsAg含量

3 討 論

HBV病毒基因組小，復(fù)制效率極高，同時(shí)在復(fù)制過程中雖存在逆轉(zhuǎn)錄過程，但缺乏相應(yīng)的校對機(jī)制，使HBV基因組極易出現(xiàn)變異[4- 5]。其中HBV的preS/S區(qū)是最容易發(fā)生突變的。目前有許多與HCC相關(guān)的HBV突變研究報(bào)道，如preS/S區(qū)的C7A、T53C、C105T等突變[6- 8]。

關(guān)于preS/S區(qū)突變致HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制有多種學(xué)說：(1)GGH的產(chǎn)生：HBsAg在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中過度積累可形成玻璃樣肝細(xì)胞(GGHs)，GGH又分為I型GGH和II型GGH，一般情況下，呈包涵體樣聚集在肝細(xì)胞的preS1形成I型GGH，聚集在肝細(xì)胞的邊緣preS2形成II型GGH。目前認(rèn)為II型GGH與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，通過產(chǎn)生大量的活性氧、引起DNA的氧化損傷等促進(jìn)HCC的發(fā)生和發(fā)展[9]；(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：目前認(rèn)為有3條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與preS2有關(guān)，一是mTOR信號途徑，preS2變異體通過激活mTOR信號途徑影響脂類代謝而導(dǎo)致HCC的發(fā)生發(fā)展；二是κβ和p38絲裂原活化蛋白激酶途徑，通過上調(diào)環(huán)氧化酶2，促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的進(jìn)程而與HCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)；三是通過激活鈣依賴的蛋白酶I- 鈣蛋白酶引起細(xì)胞中心體過度復(fù)制而促進(jìn)HCC的發(fā)生[10- 12]；(3)反式轉(zhuǎn)錄激活作用：preS/S區(qū)的3′端截短產(chǎn)物可反式激活癌基因c- myc，使c- myc基因表達(dá)異常而干擾細(xì)胞的增殖和凋亡，從而促進(jìn)HCC的發(fā)生[13]。

本實(shí)驗(yàn)中，23例HCC患者的術(shù)后癌組織中有9例存在T3098C突變，T3098C突變生存時(shí)間分析表明，發(fā)生T3098C突變的肝癌患者的生存時(shí)間長于未發(fā)生突變的肝癌患者，同時(shí)通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析發(fā)現(xiàn)，T3098C突變是HCC術(shù)后的患者獨(dú)立的保護(hù)預(yù)后預(yù)測因素。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T3098C突變可能抑制HBsAg的合成和促進(jìn)HBsAg的分泌。因此，我們推測，T3098C突變可能通過降低HBsAg的合成和促進(jìn)HBsAg分泌而成為HCC患者獨(dú)立的保護(hù)預(yù)后預(yù)測因素。