蟬花提取物促進(jìn)釀酒酵母壽命延長的機(jī)制研究

楊 力, 閆孟利, 劉 科

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生物環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610065)

1 引 言

活性氧(ROS)在細(xì)胞呼吸過程中被認(rèn)為是分子氧的代謝物， 由于其不成對的電子而具有很強(qiáng)的反應(yīng)活性[1-2].活性氧參與許多重要的細(xì)胞活動， 包括基因轉(zhuǎn)錄， 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫應(yīng)答[3].低水平的ROS可能對機(jī)體產(chǎn)生有益作用， 但其過量產(chǎn)生涉及到各種慢性疾病和退行性疾病的發(fā)展， 例如癌癥， 呼吸系統(tǒng)疾病， 神經(jīng)退行性疾病和消化系統(tǒng)疾病[4-5].在生理?xiàng)l件下， ROS的濃度受到抗氧化劑的微妙調(diào)節(jié).通過補(bǔ)充抗氧化劑能夠減少內(nèi)源性抗氧化劑消耗， 從而在一些臨床研究中減輕相關(guān)的氧化損傷[6].天然抗氧化劑具有清除ROS功能， 對腫瘤、心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等都有明顯的防治作用[7-8].

該文選取了我國傳統(tǒng)的中草藥蟬花， 探究其作為一種天然抗氧化劑的潛力， 研究蟬花提取物(CCE)在促進(jìn)釀酒酵母的氧化脅迫應(yīng)答， 抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老中的作用[9]， 研究發(fā)現(xiàn)CCE能夠通過誘導(dǎo)抗氧化防御基因SOD2、CTT1的轉(zhuǎn)錄， 增強(qiáng)釀酒酵母的抗氧脅迫能力， 降低胞內(nèi)活性氧的水平， 從而延長釀酒酵母的時序性壽命.該研究對以蟬花為代表的我國傳統(tǒng)中藥的開發(fā)和應(yīng)用具有參考意義.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 試劑 野生型釀酒酵母BY4742 (本實(shí)驗(yàn)室提供)， 蟬花干粉(浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司)， 氨基酸(Biotopped)， 無水葡萄糖(成都科龍?jiān)噭?， YNB(BD公司， 291930)， 酵母提取物(OXODID)， 胰蛋白胨(Solarbio)， 瓊脂粉(Biofroxx)， DCFH-DA(Sigma公司)， RNA 提取試劑盒(TIANGEN)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(碧云天生物公司)， 實(shí)時熒光定量試劑盒 (碧云天生物公司).

2.1.2 主要儀器和設(shè)備 氣浴恒溫振蕩器(鴻科儀器)， SW-CJ-1C超凈工作臺(中國蘇州安泰)， 一次性0.22 μM除菌濾器(Millipore 公司)， 倒置熒光顯微鏡(Leica DMi8)， CFX manager real-time PCR系統(tǒng)(美國 Bio-Rad)， 超純水處理系統(tǒng)(美國 Millipore 公司)， pH計(jì)(中國上?？祪x)， 立式壓力蒸汽滅菌鍋(中國上海申安醫(yī)療).

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 蟬花提取物的制備 將2 g蟬花干粉， 20 mL 95% 乙醇放入帶磨口塞的50 mL錐形瓶中(蓋上塞子)， 混勻， 于30 ℃ 200 r/min振蕩48 h， 過濾后收集濾液.40 ℃ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾液， 得到淡黃色粉末狀的CCE.將CCE溶于無水乙醇， 配成50 mg/mL CCE醇溶液置于4 ℃ 冰箱備用[8].

2.2.2 酵母細(xì)胞的培養(yǎng) 將野生型釀酒酵母BY4742于YPD固體培養(yǎng)基活化， 挑取單菌落接種于SDC-2% Glucose液體培養(yǎng)基， 30 ℃、200 r/min恒溫培養(yǎng).

2.2.3 釀酒酵母時序性壽命(CLS)的測定 將活化的酵母細(xì)胞接種到20 mL SDC液體培養(yǎng)基， 使其在波長600 nm處的吸光度為0.005.接種時向CCE 處理組中加入終濃度為1.000 mg/mL 的CCE.30 ℃， 200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng).每個樣品3個平行樣， 培養(yǎng)至飽和后， 取菌液稀釋10萬倍.取適量菌液均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基， 倒置于30 ℃ 培養(yǎng)箱生長2～3 d， 統(tǒng)計(jì)YPD固體培養(yǎng)基上的菌落數(shù)(A).之后每隔1天重復(fù)以上步驟， 依次獲得菌落數(shù)(B、C...).A/A、B/A、C/A...則表示存活菌落所占的比例， 以存活菌落所占比例為縱坐標(biāo)、時間為橫坐標(biāo)所繪制的曲線代表釀酒酵母的時序性壽命.

2.2.4 釀酒酵母抗氧化脅迫能力的測定 將活化的酵母細(xì)胞接種到10 mL SDC液體培養(yǎng)基， 使其在波長600 nm處的吸光度為0.005.接種時向CCE 處理組中加入終濃度為1.000 mg/mL的CCE.30 ℃， 200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h.然后取2 mL， 波長600 nm處吸光度為0.5的酵母細(xì)胞于離心管中， 離心后棄掉培養(yǎng)基.加入995 μL新鮮的SDC液體培養(yǎng)基， 混勻.向H2O2處理組中加入5 μL 10 mol/L H2O2， 分別處理30 min和60 min后逐級稀釋10倍， 稀釋4次.然后按濃度由低到高， 從右往左依次點(diǎn)樣于YPD固體培養(yǎng)基上， 最后將培養(yǎng)基倒置于30 ℃ 培養(yǎng)箱生長2～3 d.

2.2.5 釀酒酵母細(xì)胞內(nèi) ROS 水平的測定 將活化的酵母細(xì)胞接種到20 mL SDC液體培養(yǎng)基， 使其在波長600 nm處的吸光度為0.005.接種時向CCE處理組中加入終濃度為1.000 mg/mL的CCE.30 ℃， 200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h.然后取2 mL， 波長600 nm處吸光度為0.5的酵母細(xì)胞于EP管中， 離心后棄掉培養(yǎng)基.每個樣品中加入含有10 μmol/L DCFH-DA探針的PBS緩沖液1 mL， 于30 ℃ 避光孵育.1 h后棄去探針孵育液， 用PBS緩沖液洗滌兩遍.然后向H2O2處理組中加入2 mmol/L H2O2， 其余實(shí)驗(yàn)組中加入等體積的PBS緩沖液作為對照， 孵育1 h.然后在熒光顯微鏡下觀察ROS的變化(激發(fā)波長為488 nm， 發(fā)射波長為525 nm).做三組獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn).

2.2.6 實(shí)時熒光定量PCR檢測CAT、SOD1、SOD2、GPX2 基因表達(dá) 將活化的酵母細(xì)胞接種到10 mL SDC液體培養(yǎng)基， 使其在波長600 nm處的吸光度為0.005.接種時向CCE處理組中加入終濃度為1.000 mg/mL的CCE.于30 ℃， 200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后用RNA提取試劑盒提取總RNA， 然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA， 再用實(shí)時熒光定量試劑盒分別檢測基因SOD2、CTT1、GPX2的表達(dá)量.其中， β-actin基因的上游引物為5′-CGTTCCAATTTACGCTGGTT-3′， 下游引物為5′-AGCGGTTTGCATTT- CTTGTT-3′；SOD2基因的上游引物為 5′-TTTGGCAAAGGCAATCGACG-3′， 下游引物為 5′-CGCCTGCTAGCTTTGTGTTG-3′；GPX2基因的上游引物為5′-TAATGTTGCCTCCAAGTGCG-3′， 下游引物為 5′-GGTTCCTGCTTCCCGA ACTG-3′；CTT1基因的上游引物為 5′-AGAAAGAGTTCCGGAGCGTG-3′， 下游引物為 5′-ACATTCTGGTATGGAGCGGC-3′.采用20 μL反應(yīng)體系， 反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s， 75 ℃ 1 min， 總共進(jìn)行40個循環(huán)反應(yīng)， 采用2-△△Ct計(jì)算基因表達(dá)的相對變化， 以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理.做三組獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn).

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 CCE延長釀酒酵母壽命

通過對比加藥處理組與不加藥對照組的時序性壽命， 發(fā)現(xiàn)分別加入0.050 mg/mL CCE和0.100 mg/mL CCE都會對酵母的時序性壽命產(chǎn)生有益的影響， 其延長作用隨著CCE濃度的增加而增強(qiáng)， 結(jié)果如圖1所示.

圖1 CCE 延長釀酒酵母壽命Fig.1 CCE extends the lifespan of Saccharomyces Cerevisiae

3.2 CCE 增強(qiáng)釀酒酵母的抗氧化脅迫能力

通過對比加藥處理組與不加藥對照組對H2O2引起的氧化脅迫抵抗能力， 發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入H2O2后反應(yīng)30 min， 其抗氧化脅迫能力增強(qiáng)的不明顯；當(dāng)加入H2O2后反應(yīng)60 min， 其加藥組0.050 mg/mL CCE和0.100 mg/mL CCE 都能一定程度的增強(qiáng)釀酒酵母的抗氧化脅迫能力， 并且其增強(qiáng)效果隨著CCE濃度的增加而增強(qiáng)， 結(jié)果見圖2.

圖2 CCE 增強(qiáng)釀酒酵母的抗氧化脅迫能力Fig.2 CCE enhances the anti-oxidant capacity of Saccharomyces Cerevisiae

3.3 CCE 抑制H2O2誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生

使用DCFH-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS， 其原理是DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)過酶切反應(yīng)生成DCFH， DCFH能與ROS反應(yīng)生成發(fā)綠色熒光的DCF， 其熒光強(qiáng)度與ROS的含量成正比.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 加入0.100 mg/mL CCE處理組中的細(xì)胞內(nèi)ROS含量弱于不加藥對照組(Control)細(xì)胞， Control+H2O2組細(xì)胞內(nèi)的ROS含量對比Control組細(xì)胞顯著增加；雖然CCE + H2O2組細(xì)胞內(nèi)的ROS含量也比CCE組細(xì)胞高, 但卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Control+H2O2組細(xì)胞內(nèi)的ROS含量， 如圖3所示.證明CCE可明顯抑制釀酒酵母中由H2O2誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生.

3.4 CCE 對 SOD2 、GPX2和 CTT1基因表達(dá)的影響

SOD2、GPX2和CTT1基因的相對表達(dá)量如圖4所示， 0.100 mg/mL CCE處理組中SOD2和CTT1的mRNA 水平都上調(diào)了3倍左右， 可知CCE可以明顯提高釀酒酵母SOD2和CTT1基因在mRNA水平的表達(dá)；而CCE對GPX2基因在mRNA水平的表達(dá)沒有明顯影響.證明CCE的抗氧化活性主要是通過上調(diào)SOD2和CTT1的表達(dá)所致.

圖3 CCE 抑制 H2O2 誘導(dǎo)的 ROS 產(chǎn)生

酵母細(xì)胞經(jīng)0.100 mg/mL的CCE處理24 h， 之后孵育DCFH-DA探針1 h， PBS 洗滌兩遍之后， 加入2 mmol/L H2O2處理1 h， 在熒光顯微鏡下觀察ROS水平

Fig.3 CCE inhibits H2O2-induced ROS production

Yeastcells were pre-treated with CCE at 0.100 mg/mL for 24 h,and then were stained using DCFH-DA for 1 h, washed twice with PBS. Yeast cells were treated with 2 mmol/L H2O2for 1 h, and the ROS level were detected under a fluorescence microscope.

4 討 論

很多研究表明衰老是源自于氧化脅迫所導(dǎo)致的有機(jī)體在氧化防御、免疫功能、代謝調(diào)控等方面所產(chǎn)生的損傷[10-12]， 固而增強(qiáng)生物體的抗氧化能力是抵抗衰老的一種有效手段.蟬花作為一種在我國已經(jīng)有上千年藥用歷史的傳統(tǒng)中藥， 具有增強(qiáng)人體抗氧化的能力， 但其有效活性成分一直不甚明確， 因此將蟬花活性成分進(jìn)行萃取， 進(jìn)而檢測它們對細(xì)胞的作用效果是一種行之有效的方法.本文從抗氧化脅迫的角度出發(fā)， 以釀酒酵母為研究模型， 檢測CCE對酵母細(xì)胞氧化脅迫應(yīng)答的影響.結(jié)果顯示， CCE處理能夠延長釀酒酵母的時序性壽命.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， CCE處理能夠增強(qiáng)釀酒酵母的抗氧化脅迫能力并且其增強(qiáng)效果隨著 CCE濃度的增加而增強(qiáng)， CCE處理還顯著的降低了由H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的上升；通過對細(xì)胞內(nèi)具有抗氧化能力的一些基因SOD2、CTT1、GPX2的表達(dá)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)， CCE能夠顯著地促進(jìn)CTT1和SOD2基因在mRNA水平的表達(dá).最后我們得出結(jié)論：蟬花提取物(CCE)能夠通過誘導(dǎo)抗氧化防御基因CTT1和SOD2的表達(dá)， 增強(qiáng)釀酒酵母的抗氧化脅迫能力， 降低胞內(nèi)活性氧的水平， 延長釀酒酵母的時序性壽命.