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    抗菌肽殺菌效果、機(jī)制研究方法進(jìn)展

    2020-01-09 20:46:35時(shí)志琪連凱琪林正丹馬園園
    中國(guó)畜禽種業(yè) 2020年11期
    關(guān)鍵詞:天青計(jì)數(shù)法抗菌肽

    時(shí)志琪 連凱琪 林正丹 馬園園

    (安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院/河南省動(dòng)物疫病防控與營(yíng)養(yǎng)免疫院士工作站/河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 455000)

    抗菌肽是機(jī)體內(nèi)抵御體外病原感染時(shí)生成的一類小分子物質(zhì),構(gòu)成生物體內(nèi)的天然保護(hù)屏障,可以通過直接殺傷病原微生物或通過調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫系統(tǒng)抵御入侵,對(duì)多種病原微生物具有抑制作用,如病毒、真菌、細(xì)菌、寄生蟲等,也能殺死變異的腫瘤細(xì)胞等[1]??咕牡膩碓词謴V泛,包括昆蟲、哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、魚類、軟體動(dòng)物和甲殼類動(dòng)物及植物等[2]。近些年,抗生素不科學(xué)地使用造成了很多嚴(yán)重的問題,尋找抗生素替代品迫在眉睫。因抗菌肽的抗菌譜廣、種類多、抗菌機(jī)理獨(dú)特、不容易產(chǎn)生耐藥性,通常被認(rèn)為是很具應(yīng)用前景的抗生素替代品[3]。本文基于前人的研究,對(duì)抗菌肽殺菌效果、最小抑菌濃度、殺菌動(dòng)力學(xué)曲線及殺菌機(jī)制的研究方法展開綜述,為以后抗菌肽的研究做鋪墊。

    1 抗菌肽抑菌效果研究方法

    1.1 濾紙片法

    濾紙片法是做細(xì)菌藥敏試驗(yàn)的常用方法,研究者借鑒該方法對(duì)抗菌肽的抑菌效果進(jìn)行研究。潘曉倩等[4]用濾紙片法研究不同濃度抗菌肽Nisin 對(duì)3 種不同細(xì)菌的抑菌效果。濾紙片法操作簡(jiǎn)單,結(jié)果直觀,但無法控制濾紙片對(duì)抗菌肽的吸附量(即無法做到對(duì)實(shí)驗(yàn)的定量),重復(fù)性較差。

    1.2 牛津杯法

    牛津杯法是國(guó)內(nèi)外測(cè)定抗菌肽效價(jià)的通用方法,但若是使用方法或者操作不當(dāng),容易出現(xiàn)抑菌圈不明顯甚至無抑菌圈等現(xiàn)象。潘曉倩等[4]利用牛津杯法對(duì)抗菌肽Nisin 對(duì)不同細(xì)菌的抑菌活力進(jìn)行測(cè)定。此法可以做到對(duì)加入的抗菌肽定量,但需要的劑量較大,且操作較為復(fù)雜,在放置牛津杯時(shí)力度不易掌控,容易滑動(dòng)甚至倒翻,需要操作者有嫻熟的操作技巧和經(jīng)驗(yàn)。

    1.3 打孔法

    殺菌效果的研究方法中打孔法較為常用。該法操作簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,且可以做到定量,對(duì)操作者的要求也相對(duì)較低,是殺菌效果研究方法中較為理想的一種,因此,在抗菌肽抑菌效果研究中經(jīng)常被使用。王利鋒等[5]曾用打孔法研究大鯢皮膚分泌液中抗菌肽對(duì)不同細(xì)菌的抑菌效果。

    1.4 活菌計(jì)數(shù)法

    活菌計(jì)數(shù)法是取一定量經(jīng)抗菌肽處理后的菌液進(jìn)行涂板,培養(yǎng)一定時(shí)間后記錄平板上的活菌數(shù)量。姜太玲等[6]用活菌計(jì)數(shù)法研究花椒籽蛋白抗菌肽的抑菌效果。這一方法最大的不足之處就是工作量較大,每一個(gè)濃度的涂板至少要重復(fù)3 次。但其操作簡(jiǎn)單,結(jié)果直觀準(zhǔn)確,可以很好地判斷抗菌肽的殺菌效果。

    2 抗菌肽最小抑菌濃度檢測(cè)方法

    2.1 刃天青顯色法

    利用刃天青具有氧化還原這一特性,對(duì)抗菌肽的最小抑菌濃度進(jìn)行測(cè)定。即將刃天青加入無菌液體中呈原本的藍(lán)色,加入有菌的液體中會(huì)變色呈紅色。鐘亨任[7]利用刃天青顯色法鑒定了抗菌肽Brevinin-GR23 對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度。利用該方法鑒定最小抑菌濃度時(shí),可以在培養(yǎng)結(jié)束后先目測(cè)渾濁度,對(duì)其抑菌效果進(jìn)行初步判斷,然后再加刃天青顯色,使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。但操作一定要十分嚴(yán)謹(jǐn),做到完全定量,否則容易出現(xiàn)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果不一致的問題。

    2.2 測(cè)吸光度法

    抗菌肽的最小抑菌濃度也可以通過測(cè)吸光度來判斷,鐘亨任[7]在做刃天青的同時(shí)也測(cè)了吸光值。其結(jié)果與刃天青顯色法結(jié)果一致。但影響吸光值的因素有很多,這些因素會(huì)造成結(jié)果不準(zhǔn)確,因此,該方法判定最小抑菌濃度的可信度較低,僅可作為參考。

    3 殺菌動(dòng)力學(xué)曲線研究方法

    3.1 測(cè)OD 值法

    對(duì)抗菌肽殺菌動(dòng)力學(xué)曲線的研究,趙雪芹[8]曾采用測(cè)OD值法,研究沙門氏菌經(jīng)不同濃度抗菌肽處理后,在不同培養(yǎng)時(shí)間下的存活量,結(jié)果顯示,該抗菌肽對(duì)沙門氏菌有很好的殺菌效果,且呈劑量依賴性。該方法操作簡(jiǎn)單,工作量小,耗時(shí)短,但影響OD 值的因素較多,得出的數(shù)據(jù)誤差較大,可靠性低。

    3.2 平板計(jì)數(shù)法

    張煒[9]等采用平板計(jì)數(shù)法研究抗菌肽對(duì)大腸桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線,結(jié)果表明該,抗菌肽對(duì)大腸桿菌有明顯的抑制作用,可以很好地殺死大腸桿菌,且呈時(shí)間依賴性。在利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定抗菌肽的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線時(shí),每一個(gè)濃度涂板至少需要重復(fù)3 次,工作量大大增加。與測(cè)OD 值法相比,雖然平板計(jì)數(shù)的工作量較大,但其結(jié)果更直觀、更準(zhǔn)確。

    4 抗菌肽抑菌機(jī)制的研究方法

    抗菌肽的抑菌機(jī)制有很多,可通過改變細(xì)胞膜的通透性,破壞細(xì)胞膜的完整性;與DNA 作用,影響蛋白質(zhì)的合成等來達(dá)到抑菌作用。研究者通過熒光染色、電鏡觀察、凝膠阻滯電泳等方法對(duì)抗菌肽的抑菌機(jī)制進(jìn)行研究。

    4.1 熒光染色法

    抗菌肽可以增加細(xì)胞膜的通透性,使細(xì)胞膜的完整性受損而達(dá)到殺菌作用。碘化丙啶(PI)作為一種熒光顯色劑,可以穿過破損的細(xì)胞膜對(duì)細(xì)菌染色。Qinghua Zhang 等[10]通過測(cè)定細(xì)菌對(duì)PI 的吸收來確定細(xì)菌膜通透性的改變。該方法比較直觀生動(dòng)地反應(yīng)細(xì)胞膜通透性的變化,在研究抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的研究中經(jīng)常被采用。

    4.2 電鏡觀察法

    用電子顯微鏡觀察經(jīng)抗菌肽處理的細(xì)菌能直觀地看出抗菌肽對(duì)細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用。謝海偉等[11]使用電鏡觀察合成抗菌肽對(duì)大腸桿菌F41 的作用,結(jié)果顯示,細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)產(chǎn)生了很明顯的變化;馮興軍等[12]通過透射電鏡觀察經(jīng)鴨抗菌肽處理后的大腸桿菌的結(jié)構(gòu)形態(tài)。該方法最直接顯示抗菌肽對(duì)細(xì)胞的殺傷效果,通常作為抗菌肽殺菌的重要數(shù)據(jù),但需要較高的試驗(yàn)儀器,透射電鏡和掃描電鏡。

    4.3 凝膠阻滯電泳法

    抗菌肽還可以通過與DNA 的作用來發(fā)揮其抑菌效果。裴志花[13]檢測(cè)家蠅抗菌肽MDAP-2 與DNA 的結(jié)合能力。吳希[14]研究表明,抗菌肽能與真菌的DNA 和RNA 結(jié)合。該方法也是研究抗菌肽抑制細(xì)菌的一種分子檢測(cè)方法,通常被作為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗菌肽是否作用于細(xì)菌DNA 的檢測(cè)手段。

    5 小結(jié)

    隨著抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)及對(duì)環(huán)境污染的日益嚴(yán)重,學(xué)者們?cè)絹碓街匾暱咕姆矫娴难芯俊?咕囊志Ч鸵志鷻C(jī)制的研究方法很多,筆者在抗菌肽現(xiàn)有研究方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行歸納總結(jié),比較研究了抗菌肽抑菌作用更合適的方法。本文簡(jiǎn)要概述抗菌肽殺菌效果、最小抑菌濃度、殺菌動(dòng)力學(xué)曲線及殺菌機(jī)制的研究方法,通過比較前人研究基礎(chǔ)推測(cè),殺菌效果的研究方法中打孔法最優(yōu);MIC 測(cè)定最優(yōu)方法為刃天青顯色法,而殺菌動(dòng)力學(xué)曲線使用平板計(jì)數(shù)法最為準(zhǔn)確;對(duì)于殺菌機(jī)制的研究,不同的殺菌機(jī)制需要不同的研究方法。當(dāng)然,隨著不斷地探索和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,也許會(huì)有更好的研究方法可以更全面、深入地研究抗菌肽。

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