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      重組禽流感病毒(H5+H7)二價(jià)滅活苗的不同免疫程序?qū)S羽肉雞免疫的效果分析

      2020-01-09 01:25:48王孝德禹婷婷李志賢虞與理
      關(guān)鍵詞:二價(jià)活苗母源

      王孝德,禹婷婷,李志賢,虞與理,胡 杰

      (1.賀州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,賀州542800;2.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,南寧530001)

      流感病毒分為A、B、C三型,三型之間的同源性較低[1]。禽流感(avian influenza,AI)是由A型流感病毒引起的急性高度接觸性傳染病,我國(guó)將其列為一類傳染病。禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)屬于正粘病毒科,單股負(fù)鏈RNA病毒,基因組總長(zhǎng)13.6 kb,分為8個(gè)節(jié)段,易于發(fā)生變異和病毒重組[2]。

      2017年6月前,我國(guó)僅對(duì)高致病性禽流感(H5亞型)進(jìn)行強(qiáng)制性免疫。H7N9流感病毒在禽類身上呈現(xiàn)低致病性,但對(duì)人類則顯現(xiàn)高致病力[3],感染H7N9流感病毒的禽(雞)不發(fā)病,僅攜帶病毒[4]。近年來(lái),由于H7N9流感毒株變異逐漸頻繁,不斷涌現(xiàn)出新的毒株,毒力逐漸增強(qiáng),H7N9亞型流感病毒變異株對(duì)雞表現(xiàn)超強(qiáng)毒力[5],發(fā)病率和死亡率極高,對(duì)家禽危害大,給人民的生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[6]。因此,2017年6月5日農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳要求2017年7月上旬在廣東省、廣西壯族自治區(qū)啟動(dòng)H7N9免疫工作,同時(shí)也要求對(duì)疫苗的安全性和免疫效力效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)[7]。因此,如何科學(xué)、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)疫苗效果,對(duì)防控禽流感至關(guān)重要。國(guó)家新推薦使用的重組禽流感病毒(H5+H7)二價(jià)滅活苗(H5N1Re-8株+H7N9 H7- Re1株)免疫程序、免疫效果如何,相關(guān)資料報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)監(jiān)測(cè)黃羽肉雞不同免疫程序下的抗體消長(zhǎng)規(guī)律、抗體持續(xù)時(shí)間、免疫抗體滴度變化情況,評(píng)估重組禽流感病毒(H5+H7)二價(jià)滅活苗(H5N1Re-8株+H7N9 H7-Re1株)的免疫效果,為禽流感的綜合防控提供理論參考,也為養(yǎng)殖企業(yè)或個(gè)體養(yǎng)殖戶的免疫防控提供依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 疫苗重組禽流感病毒(H5+H7)二價(jià)滅活苗(H5N1Re-8株+H7N9 H7- Re1株),簡(jiǎn)稱(H5+H7)二價(jià)滅活苗(下同),哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn),政府采購(gòu)苗,批號(hào)為2017026。

      1.2 試驗(yàn)動(dòng)物本地規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)臨床健康的10日齡360只黃羽肉雞(三黃雞),隨機(jī)分成A、B、C 3組,每組120只,用戴腳環(huán)的方式進(jìn)行標(biāo)記。

      1.3 檢測(cè)試劑禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原和禽流感病毒H5亞型陽(yáng)性血清以及禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原和禽流感病毒H7亞型陽(yáng)性血清以及H7N9 H7-Re1株HI抗原和陽(yáng)性血清,均購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。其中,禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原和禽流感病毒H5亞型陽(yáng)性血清批號(hào)分別為2017001和2016003,有效期分別至2019年04月27日和2018年11月16日;禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原和禽流感病毒H7亞型陽(yáng)性血清批號(hào)分別為2017007和2017004,有效期分別至2019年4月18日和2019年6月26。1%雞紅細(xì)胞懸液稀釋液和pH7.2~7.4的磷酸鹽緩沖溶液按GB/T18936-2003中的配方由賀州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室自配。

      1.4 免疫方式及采血時(shí)間A組:即在34日齡肌肉注射0.5 mL/只(H5+H7)二價(jià)滅活苗,于免疫前0 d及免疫后第14、28、42、56、86 d,分別采集雞血,分離血清,-20 ℃保存?zhèn)溆?。B組:即在10日齡和20日齡雞,分別頸部皮下注射0.1 mL/只(H5+H7)二價(jià)滅活苗;于免疫前0 d、一免后第7 d以及二免后第14、28、42、56、70、100 d,分別采集雞血,分離血清,-20 ℃保存?zhèn)溆?。C組:即在 20日齡和40日齡分別肌肉注射0.5 mL/只(H5+H7)二價(jià)滅活苗;于免疫前0 d、一免后第14 d、二免后第8、22、36、50、80 d,分別采集雞血,分離血清,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.5 檢測(cè)方法參照GB/T18936-2003《高致病性禽流感診斷技術(shù)》中血凝(hemagglutination,HA)和血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutination inhibition,HI)方法對(duì)上述血清進(jìn)行禽流感H5和H7抗體檢測(cè);判斷標(biāo)準(zhǔn):抗體滴度≥4log2為陽(yáng)性,抗體滴度<4log2為陰性。

      1.6 數(shù)據(jù)分析利用SPSS軟件對(duì)1.2.2中的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行抗體平均滴度值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)、95%的置信區(qū)間分析。

      2 結(jié)果

      2.1 沒(méi)有出現(xiàn)免疫不良反應(yīng)試驗(yàn)雞未觀察到有精神不振、食欲減退等不良反應(yīng)。

      2.2 禽流感H5抗體情況

      2.2.1 抗體陽(yáng)性率和抗體效價(jià)變化情況 由表1可知,A組免疫后第14 d時(shí),抗體水平提升較快,抗體陽(yáng)性率達(dá)到91.67%,抗體平均滴度為6.42log2;B組在一免后第7 d時(shí),抗體陽(yáng)性率僅為10%,說(shuō)明有母源抗體的干擾,抗體提升慢,一免時(shí)間過(guò)早;二免過(guò)后第14 d,抗體提升非常迅速,抗體陽(yáng)性率達(dá)到100%,抗體平均滴度為7.43log2;C組一免后第14 d,抗體陽(yáng)性率為94.17%,抗體提升最快。

      2.2.2 禽流感H5抗體消長(zhǎng)規(guī)律 由圖1A可知,A組抗體在免疫前0 d(34日齡)時(shí)母源抗體水平低,陽(yáng)性率為0,說(shuō)明母源抗體已消退,免疫后第14 d抗體水平快速提升,免疫后第28 d抗體水平達(dá)到最高峰,平均滴度為8.09log2,抗體陽(yáng)性率為96.67%,免疫后第42 d抗體陽(yáng)性率最高為98.33%,但抗體滴度已經(jīng)下降到6.33log2,到免疫后第86 d(即出欄時(shí)),抗體滴度降為5.99log2,抗體陽(yáng)性率為89.17%(表1)。

      由圖1B可知,B組抗體水平在免疫前0 d(10日齡)時(shí)抗體滴度為6.42log2,抗體陽(yáng)性率為87.5%,說(shuō)明仍存在較高的母源抗體,免疫一針后第7 d,抗體水平很低,僅為1.09log2,說(shuō)明并未產(chǎn)生抗體,也有可能是母源抗體干擾,一免第10 d后,緊接著二免,二免后第14 d,抗體水平快速提升,抗體滴度達(dá)到了7.43log2,抗體陽(yáng)性率達(dá)到100%,二免后第28 d抗體水平達(dá)到最高峰,平均滴度為8.45log2,抗體陽(yáng)性率為100%,二免后第42 d抗體水平開(kāi)始下降,到二免后第100 d(即出欄時(shí))時(shí)滴度已經(jīng)下降到6.27log2,抗體陽(yáng)性率為83.33%(表1)。

      由圖1C可知,C組抗體水平在免疫前0 d(20日齡)時(shí)抗體滴度為2.01log2,抗體陽(yáng)性率僅為6.67%,說(shuō)明母源抗體基本消退,免疫一針后14 d,抗體水平快速提升,抗體滴度為6.88 log2,抗體合格率達(dá)94.17%,一免第20 d后開(kāi)始二次免疫,二免后第8 d抗體水平開(kāi)始提升,抗體滴度達(dá)7.15 log2,抗體陽(yáng)性率達(dá)99.17%,到二免后第22 d抗體滴度達(dá)到最高峰,平均滴度為8.63log2,以后抗體滴度緩慢下降,但抗體陽(yáng)性率100%狀況一直維持到二免后第50 d,到二免后第80 d(即出欄)時(shí)滴度已經(jīng)下降到7.45log2,抗體合格率仍高達(dá)為95.83%(表1)。

      圖1 AIV H5抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.1 AIV H5 antibody test results

      2.3 禽流感H7抗體情況

      2.3.1 抗體陽(yáng)性率和抗體效價(jià)變化情況 由表2可知,A組于34 d日齡實(shí)行一針免疫,免疫后第14 d抗體水平有一定提升,抗體平均滴度為4.72log2,抗體陽(yáng)性率為78.33%;B組在一免后第7 d,抗體陽(yáng)性率僅為7.5%,說(shuō)明有母源抗體的干擾,抗體提升慢,二免后第14 d,抗體提升較快,抗體陽(yáng)性率達(dá)到93.33%,抗體平均滴度為5.96log2;C組一免后第14 d,抗體陽(yáng)性率為93.33%,抗體提升最快,抗體平均滴度為6.88log2。

      2.3.2 禽流感H7抗體消長(zhǎng)規(guī)律 由圖2A可知,A組抗體在免疫前0 d(34 d日齡)時(shí)母抗體水平低,僅有10%的陽(yáng)性率,說(shuō)明母源抗體消退明顯,免疫一針后14 d快速提升,免疫后第28 d抗體達(dá)到最高峰,平均滴度為7.59log2,抗體陽(yáng)性率為96.67%,然后抗體逐漸緩慢下降,抗體陽(yáng)性率變化不明顯,免疫后第86 d(即出欄時(shí)),抗體滴度降為5.31log2,抗體陽(yáng)性率86.67%(表2)。

      表1 禽流感H5 抗體檢測(cè)結(jié)果Table 1 AIV H5 antibody test results

      由圖2B可知,B組抗體水平在免疫前0 d(10日齡)時(shí)抗體滴度為6.17log2,抗體陽(yáng)性率為82.5%,說(shuō)明還存在較高的母源抗體,免疫一針后第7 d,抗體水平很低,僅為1.75log2,說(shuō)明并未產(chǎn)生抗體,也有可能是母源抗體干擾,一免10 d后進(jìn)行二免,二免后第14 d,抗體水平快速提升,抗體滴度為5.96log2,抗體陽(yáng)性率達(dá)到93.33%,隨后抗體水平不斷提升,二免后第42 d抗體達(dá)到最高峰,平均滴度為7.58log2,然后抗體緩慢回落,到二免后第100 d(即出欄)時(shí)抗體滴度已經(jīng)下降到5.87log2,抗體陽(yáng)性率為80.83%(表2)。

      由圖2C可知,C組的抗體在免疫前0 d(20日齡)時(shí)抗體滴度為2.01log2,抗體陽(yáng)性率僅為6.64%,說(shuō)明母源抗體基本消退,免疫一針后第14 d,抗體水平快速提升,抗體滴度為6.44log2,抗體合格率達(dá)到93.33%,一免20 d后開(kāi)始二次免疫,二免后第8 d抗體水平開(kāi)始提升,抗體滴度達(dá)7.53 log2,抗體陽(yáng)性率達(dá)到98.33%,到二免后第22 d, 抗體滴度達(dá)到最高峰,為8.77log2,以后抗體滴度緩慢下降,到二免后第80 d(即出欄時(shí))時(shí)抗體滴度仍有7.43log2,抗體陽(yáng)性率仍高達(dá)為92.5%(表2)。

      圖2 禽流感H7抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.2 AIV H7 antibody test results

      3 討論

      3.1 本次試驗(yàn)20日齡和40日齡各免疫一次組(C組)免疫效果較好C組的抗體滴度值、抗體均勻度、抗體高峰期的維持時(shí)間均優(yōu)于其他兩組。A組雖然抗體提升也較快,但抗體高峰期維持時(shí)間太短,抗體衰減速度快于B組、C組。因此,二次免疫的效果要比一次免疫的效果要好[8]。B組考慮三黃雞雞體格較小,一免日齡小,選擇的免疫劑量0.1 mL,低于廠家說(shuō)明書(shū)要求的0.3 mL/只,二免后雖然抗體有所提升,但抗體平均滴度低于C組,變異系數(shù)大于C組,B組免疫劑量不足是造成B組免疫效果不如C組的原因之一[9]。

      3.2 (H5+H7)二價(jià)滅活苗的免疫效果好選擇的三種免疫程序,用(H5+H7)二價(jià)滅活苗免疫的黃羽肉雞,H5和H7的抗體群體陽(yáng)性率都達(dá)到了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部70%以上的要求。在首免14 d 后,H5 亞型和H7亞型抗體陽(yáng)性率都可達(dá)78.00%以上,與楊澤林等[10]報(bào)道的H5亞型首免后第15 d,合格率(陽(yáng)性率)為10%,首免后22 d,合格率(陽(yáng)性率)為60%;H5亞型首免15 d后,合格率(陽(yáng)性率)為70%,首免后第22 d,合格率(陽(yáng)性率)為93.33%,有些差異。免疫后第14~120 d肉雞出欄,禽流感H5的抗體水平普遍比H7抗體水平高,H5、H7抗體陽(yáng)性率都在80%以上。表明(H5+H7)二價(jià)滅活苗有較好的免疫效果。

      表2 AIV H7 抗體檢測(cè)結(jié)果Table 2 AIV H7 antibody test result

      3.3 根據(jù)出欄時(shí)間的不同可采取有差別的免疫程序可根據(jù)本地不同情況,采樣不同的免疫程序。對(duì)于飼養(yǎng)生長(zhǎng)速度慢、飼養(yǎng)期在120日齡左右的黃羽肉雞規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng),最好實(shí)行首免后第20 d加強(qiáng)免疫,免疫效果更好。在農(nóng)村散養(yǎng)地區(qū),由于鄉(xiāng)村動(dòng)物防疫力量薄弱的現(xiàn)狀,首免后第20 d加強(qiáng)免疫難以全面實(shí)施的情況下,可使用一次性免疫,即可在20日齡時(shí),也能獲得達(dá)到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求的免疫效果;對(duì)于飼養(yǎng)生長(zhǎng)速度快、飼養(yǎng)期在70日齡以下的肉雞的規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng),為保障雞肉的質(zhì)量安全(疫苗注射后第28 d才可上市銷售),可實(shí)行一次性免疫或首免后第10 d加強(qiáng)免疫(B組);在有疫情發(fā)生過(guò)的區(qū)域,用首免后10日加強(qiáng)免疫(B組),使雞在較短的時(shí)間更快的獲得保護(hù)。

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