類泛素化蛋白NEDD8單克隆抗體制備

姚 威，孫海偉，霍 娜，于婉琪，蕭 颯，陳鴻軍

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，楊凌712100）

類泛素蛋白NEDD8（neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 8）最初的報道是在小鼠胚胎的腦組織中高度富集的新的mRNA[1]。NEDD8含有81個氨基酸，是一種類泛素蛋白修飾分子，與泛素分子的一致性為59%，相似性高達80%，其相似程度是眾多類泛素分子中最高的[2]。研究表明，Nedd8能像泛素一樣在體內(nèi)固有酶促作用下被共價結合到底物蛋白上，參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾，這一過程被稱為NEDDylation[3]。NEDDylation的發(fā)生機制與泛素化（Ubiquitination）[4]和SUMOylation[5-6]相似，成熟的NEDD8分子可以通過其C端的甘氨酸與UBA3半胱氨酸活性位點形成一個高能量的硫酯鍵，UBA3是NEDD8活化酶（E1）（APPBP1和UBA3組成的異源二聚體）的催化亞單位且具有ATP依賴性。而后，活化的NEDD8被轉(zhuǎn)移到結合酶E2（Ubc12/UBE2M或UBE2F）的半胱氨酸活性位點并形成硫酯鍵，最后，NEDD8被E3連接酶帶到相應的底物蛋白的賴氨酸殘基形成異肽鍵[7-8]。

迄今為止，NEDDylation修飾的底物尚未完全明確，本研究制備特異性抗NEDD8單抗，取代商品化的NEDD8抗體，進行免疫學檢測，旨在以此作為工具鑒定NEDDylation的底物。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗動物人胚腎293T細胞系、小鼠骨髓瘤SP2/0細胞系為本實驗室保存；BALB/c小鼠購自中國科學院上海斯萊克動物研究中心。

1.2 載體與主要試劑pET30a（+）原核表達載體及pcDNA3.1-2×Flag真核表達載體為本實驗室保存；BamH I、XhoI等限制性核酸內(nèi)切酶以及T4 DNA連接酶均為公司產(chǎn)品；Phanta MaxSuper-Fidelity DNA聚合酶購自南京諾唯贊生物公司；單抗（mAb）亞類鑒定試劑盒購自Southern biotech公司；3, 3, 5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺底物顯色液；增強化學發(fā)光試劑盒購自美國賽默飛公司；Hybri-Max聚乙二醇融合試劑盒、辣根過氧化酶酶標兔抗小鼠IgG、完全弗氏佐劑以及不完全弗氏佐劑均為為美國Sigma公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)基、HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Cullin-1抗體D-5購自美國Santa Cruz公司。

1.3 NEDD8 PCR擴增參照人源nedd8基因核苷酸序列（GenBank登錄號：CR407662.1），設計并合成了擴增nedd8基因全長的特異性引物。上游引物nedd8-F：5'-CGCGGATCCATGCTAATTAAAGTG AAGACGCTGA-3'；下游引物nedd8-F：5'-GCCC TCGAGTCACTGCCTAAGACCACCTCCTCCT-3'，引物由蘇州金唯智公司合成。收取A549細胞，利用Qiagen RNeasy試劑盒進行RNA提取，以此為模板，利用隨機引物N9反轉(zhuǎn)錄為cDNA，常規(guī)擴增nedd8基因。

1.4 重組原核表達載體及真核表達載體的構建將PCR擴增得到的目的片段用BamH I和XhoI進行雙酶切，與同樣進行雙酶切的pET30a、pcDNA3.1-2×Flag載體4℃連接過夜。然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，提取的質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切鑒定后，挑選出疑似陽性重組子的克隆送往蘇州金唯智生物科技有限公司進行最終測序，篩選出陽性重組子，原核或真核重組質(zhì)粒分別命名為pET30-Nedd8、pFlag-Nedd8。

1.5 NEDD8蛋白原核表達及鑒定將陽性重組原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取獨立菌落于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日以1∶100轉(zhuǎn)接至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達0.4～0.6時，用最終濃度為0.1～1 mmol/L的IPTG在不同溫度、時間培養(yǎng)體系進行誘導，確定最終的最佳誘導表達條件。以最佳的表達條件進行大量誘導，然后4℃離心，將離心所得的菌體送往吉爾生化（上海）有限公司進行純化及濃縮，最后將得到的表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析。

1.6 小鼠免疫及抗體制備取經(jīng)過純化的His-NEDD8蛋白為免疫原疫腹腔注射6周齡的BALB/c雌性小鼠，每隔7 d免疫一次，每次免疫量為50 μg。一免用等體積的完全弗氏佐劑包裹免疫原經(jīng)腹腔免疫，二免用等體積的不完全弗氏佐劑包裹免疫原經(jīng)腹腔免疫，三免直接用純化抗原經(jīng)腹腔免疫小鼠，三免后第3 d時按參考文獻[11]方法制備單抗[11]。

1.7 間接ELISA方法的建立對免疫小鼠及非免疫小鼠進行眼球采血，免疫小鼠血清作為陽性血清，正常非免疫小鼠血清和SP2/0上清作為陰性血清，純化的免疫原蛋白作為包被抗原，HRP標記山羊抗鼠IgG作為酶標二抗，以免疫小鼠多抗血清經(jīng)矩陣ELISA的方法確定最佳抗原包被濃度，按照常規(guī)的方法進行包備、封閉和洗滌后，4℃保存，待后續(xù)篩選單抗使用。

1.8 SDS-PAGE和Western blot鑒定正常293T細胞以及過表達pFlag-Nedd8和pFlag-Ub的293T細胞經(jīng)變性處理后，按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)印至NC膜，利用含5%脫脂乳TBST緩沖液4℃封閉過夜，加入待檢單克隆抗體，將各種抗體反應的NC膜放置于37℃中作用4 h，TBST洗滌3次，HRP標記兔抗鼠IgG室溫作用2 h，ECL顯色試劑盒曝光顯色。

1.9 免疫共沉淀（Co-immuno-precipitation，Co-IP）293T細胞鋪10 cm細胞培養(yǎng)皿，待細胞長滿后棄細胞上清，用常溫PBS洗2遍。向培養(yǎng)皿中加入1 mL弱性RIPA細胞裂解液置于冰上裂解30～45 min，中間每隔15 min輕輕晃動培養(yǎng)皿使裂解液均勻分布。將裂解液收集到離心管中于4℃、13 400×g離心10 min。將裂解液分裝到2個離心管中，每個離心管中分別加入30 μL的Protein A/G，同時分別加入2 μL Cullin-1抗體和鼠源IgG作為陰性對照。另外取40 μL的裂解產(chǎn)物加入10 μL的5×SDS Loading buffer，95℃加熱樣品10 min，該樣品作為IP實驗的對照?？贵w、蛋白裂解液及protein A/G共孵育5 h后,用IP裂解液洗滌3～4次，用40 μL IP裂解液重懸Protein A/G Agarose并加入10 μL 5×SDS Loading buffer煮樣。4℃、10 800×g離心10 min，取上清，將Input、IgG對照、IP樣品進行SDS-PAGE，然后進行后續(xù)的Western blot分析。同樣的方法用制備的單克隆抗體進行免疫共沉淀實驗。

1.10 NEDD8抗原表位鑒定根據(jù)NEDD8蛋白疏水區(qū)及親水區(qū)，將nedd8基因分成不同的截短體，通過同源重組的方法克隆至pET30a載體上。所用引物如下：N8-R：5'-CTCGAGCACCACCACCAC-3'；N829aa-F：5'-GTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAA CGCTCC TTGATTCG-3'；N838aa-F: 5'-GTGGTGG TGGTGCTCGAGTCATGGGGGGATTCCCTC-3'；N847aa-F: 5'-GTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGCC ACTGTAGATGAG-3'；N858aa-F: 5'-GTGGTGGT GGTGCTCGAGTCAATCAGCTGCTGTCTT-3'。重組載體分別命名為pET30-NEDD8 (1～29aa)、pET30-NEDD8 (1～38aa)、pET30-NEDD8 （1～47aa）、pET30-NEDD8（1～58aa）。將陽性重組原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，進行原核表達，Western blot檢測NEDD8單克隆抗體針對的抗原表位。

2 結果

2.1 原核重組質(zhì)粒pET30-Nedd8鑒定參照人源nedd8核苷酸序列，設計并合成了擴增nedd8基因全長的特異性引物，從A549基因組中擴增出nedd8片段，大小為243 bp，經(jīng)雙酶切后克隆入載體pET30a(+)中，經(jīng)過PCR鑒定和測序，nedd8基因已經(jīng)被正確插入到表達載體中，且方向正確閱讀框完整，無堿基突變，表明已成功構建原核表達重組質(zhì)粒pET-Nedd8。

2.2 重組蛋白的表達和純化結果將構建好的pETNedd8轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)過條件優(yōu)化，確定在37℃條件下，經(jīng)1 mmol/L的IPTG誘導8 h時，可溶性rNEDD8蛋白的產(chǎn)量最高。由圖1可見，rNEDD8蛋白在上清及包涵體中均有大量表達。大量誘導表達之后，送往上海吉爾生化公司純化，由圖2可見，純化結果良好，純化后的蛋白濃度為0.51 mg/mL。

2.3 間接ELISA方法建立每只小鼠免疫50 μg純化蛋白，共進行3次免疫，在最后一次免疫后72 h之內(nèi)進行細胞融合[11]。根據(jù)ELISA矩陣法，確定蛋白的最佳包被濃度為32 ng（稀釋度為1∶1600），陽性血清和陰性血清的最佳稀釋倍數(shù)為1∶2000。

2.4 單抗制備免疫后的小鼠取脾臟進行細胞融合，利用間接ELISA以及Western blot方法進行篩選，獲得3株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為1G3、1G11、4B7。這3株單克隆抗體的OD450值維持在3.5以上，而SP2/0上清對照和陰性血清對照OD450值維持在0.5以下，對上述單抗進行亞克隆純化及擴大培養(yǎng)，分別按照常規(guī)方法制備腹水。經(jīng)間接ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，3個單克隆抗體的亞克隆株全部具有較高的ELISA效價，且分泌的抗體都能識別重組蛋白rNEDD8蛋白。在后續(xù)的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)1G11雜交瘤細胞株的ELISA效價比較穩(wěn)定，所以選擇1G11單抗作為最終的雜交瘤細胞株。mAb亞類鑒定試劑盒鑒定表明，這株mAb重鏈屬于IgG1α，輕鏈屬于κ。

2.5 Western blot檢測由圖2顯示，分泌的3個單克隆抗體均能識別重組蛋白rNEDD8。由于NEDD8蛋白與泛素蛋白Ub具有高度同源性，為了確定NEDD8單克隆抗體的特異性，本研究利用pFlag-Nedd8、pFlag-Ub質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細胞，用單克隆抗體進行Western blot檢測。結果發(fā)現(xiàn)：單抗1G11能夠特異性識別pFlag-Nedd8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞裂解產(chǎn)物，形成多條NEDD8修飾的蛋白梯度，而與pFlag-Ub質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞裂解產(chǎn)物不反應（圖2）。

2.6 Co-IP檢測結果為檢測單克隆抗體是否適用于Co-IP實驗，本研究檢測Cullin-1的NEDDylation修飾。由圖3所示，無論用Cullin-1抗體還是用1G11單抗，均可以識別被NEDD8修飾的Cullin-1蛋白，表明單抗能夠識別Cullin-1的NEDD8修飾。這說明制備的單克隆抗體具有良好的免疫反應性和特異性，且可用于Co-IP共沉淀實驗。

2.7 NEDD8抗原表位鑒定根據(jù)Protean軟件分析NEDD8蛋白的疏水區(qū)及親水區(qū)，構建不同的原核表達載體，分段表達NEDD8蛋白，長度分別為29 aa、38 aa、47 aa、58 aa以及全長。原核表達之后，經(jīng)過SDS-PAGE電泳，由從圖4A可見，各截短體蛋白都能夠獲得成功表達。將這些表達產(chǎn)物作為抗原，用1G11單抗為一抗，進行Western blot分析。由圖4B可見，29 aa長度的多肽不能夠被識別，而38 aa及以上長度的多肽的則反應性良好。結合圖4C序列比對結果，可以推斷，單克隆抗體1G11的識別表位可能在29～32 aa，該段表位的aa序列為29RVEE32，其識別區(qū)的結構模擬圖藍色球狀區(qū)域（圖4D）。

圖1 重組蛋白rNEDD8的SDS-PAGE分析Fig.1 Analysis of the recombinant protein by SDS-PAGE

圖2 單克隆抗體免疫反應和特異性分析Fig.2 Immunoreaction of specificity analysis of mAb 1G11

圖3 NEDDylated修飾Cul1修飾檢測Fig.3 Detection of NEDDylated Cullin-1 by co-IP assay

圖4 表位鑒定Fig.4 Characterization of the epitope of mAb 1G11

3 討論

NEDDylation是一種類泛素化的蛋白質(zhì)翻譯后修飾途徑。在此過程中，類泛素化小分子NEDD8通過NAE1激活酶、E2結合酶與E3連接酶的催化作用，共價結合到蛋白底物上，對其進行修飾。NEDDylation目前被認為廣泛地參與調(diào)控蛋白的活性、穩(wěn)定性、細胞定位以及蛋白間互作，與癌癥、發(fā)育疾病和病毒感染之間都存在著緊密的聯(lián)系。人免疫缺陷癥病毒多個病毒蛋白通過不同方式劫持Cullin相關的E3連接酶（CRLs）復合物，從而利用了NEDDylation修飾功能，實現(xiàn)逃避免疫和促進病毒復制[9-10]。在感染單純皰疹病毒的細胞中，NEDDylation可以通過加強CRL對IκB的泛素化，促進其在蛋白酶體的降解，進而釋放具有活性的NF-κB入核，啟動干擾素基因的轉(zhuǎn)錄[11]。而在卡波氏肉瘤病毒感染的細胞中，NEDDylation也可以通過啟動NF-κB途徑來調(diào)控病毒的潛伏期相關基因表達[12]。

NEDDylation還能夠修飾病毒蛋白，在多種病毒的生命周期中發(fā)揮重要作用，如流感病毒的PB2蛋白被NEDD8蛋白修飾后其穩(wěn)定性降低，從而抑制流感病毒的復制[13]；HDM2能夠增強乙型肝炎病毒HBx的NEDDylation修飾，從而抑制其泛素化降解，增強HBx蛋白的穩(wěn)定性及功能[14]。因此，NEDDylation類泛素化修飾途徑在天然免疫過程中發(fā)揮著重要作用。

市場上雖然已有商品化NEDD8抗體，但是在實際的實驗中操作中，并不能滿足Co-IP實驗需求。本研究制備獲得的單抗能夠特異性地識別NEDD8蛋白，能用于Co-IP實驗。這為今后更深入地研究內(nèi)源性NEDDylation修飾作用打下了良好的基礎，為更好地闡述在病毒感染中NEDDylation的免疫調(diào)控作用提供了實用的生物工具。