多殺性巴氏桿菌OmpH2對宿主Fn和Plg黏附作用的研究

陳 露，朱偉峰，魏后軍，仇汝龍，胡 波，范志宇，陳萌萌，王 芳

（1.江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，南京 210014；2.農業(yè)農村部獸用生物制品工程技術重點實驗室，南京210014；3.國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014）

多殺性巴氏桿菌可引起多種畜禽和野生動物的巴氏桿菌病[1-2]，因發(fā)病程度和感染動物不同而有不同的病名，如豬肺疫、豬進行性萎縮性鼻炎、禽霍亂、牛出血性敗血癥、兔出血性敗血癥等。近年來多殺性巴氏桿菌在多種動物中的臨床分離率或檢出率均位居細菌性病原的前列[3-5]，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。多殺性巴氏桿菌同樣可以造成人類感染發(fā)病，是一種人獸共患病病原體。與動物密切接觸的人群的血清中巴氏桿菌抗體陽性率比未接觸者高兩倍左右[6]。人類發(fā)病主要通過傷口感染?；颊邉?chuàng)口處腫脹、劇痛、發(fā)熱、形成膿腫和周圍淋巴結炎，個別病例出現(xiàn)敗血癥和腦膜炎[1-2]。目前，研究發(fā)現(xiàn)莢膜、脂多糖、外膜蛋白等毒力因子與多殺性巴氏桿菌的致病性有關[7]，但是尚不能完全清楚地解釋巴氏桿菌病發(fā)病的分子機制，也無法完全確定各毒力因子在致病中的作用[8-9]。

孔蛋白OmpH是多殺性巴氏桿菌的一種主要的外膜蛋白[10]。在多殺性巴氏桿菌的全基因組序列中，存在兩個拷貝的OmpH基因（間隔154 bp），分別編碼蛋白質OmpH1和OmpH2[11]。過去對OmpH1（通常稱為OmpH）的研究較多，現(xiàn)有研究表明OmpH是保護性抗原并具有黏附作用[12-13]。很多病原菌的黏附因子除了可以黏附宿主細胞外還可以黏附胞外基質成分（如纖維連接蛋白，F(xiàn)ibronectin，F(xiàn)n）或者通過結合宿主血漿纖維蛋白溶解酶原（Plasminogen，Plg）促進細菌對宿主細胞和組織的黏附[14-15]。已經(jīng)有學者通過招募實驗證實多殺性巴氏桿菌能夠利用Fn和Plg[16-17]。目前關于OmpH2的致病作用的報道較少，僅少量研究表明其與康復血清間存在反應[18]。OmpH2作為多殺性巴氏桿菌一種與OmpH1同源的外膜蛋白，可能也是一個黏附因子。OmpH2是否通過結合宿主Fn和Plg促進多殺性巴氏桿菌對宿主的黏附的研究具有重要意義。本文旨在通過研究OmpH2對Fn和Plg的黏附作用，從而初步揭示多殺性巴氏桿菌OmpH2分子致病機制。

1 材料和方法

1.1 質粒、菌種及培養(yǎng)pET28a（+）表達載體、BL21（DE3）宿主菌、多殺性巴氏桿菌C51-17株為本試驗室保存。多殺性巴氏桿菌使用馬丁肉湯（海博，青島）添加10% 新生牛血清（Gibco）培養(yǎng)。大腸桿菌使用（LB）（海博，青島）液體或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 序列比對從PMTB2.1菌株全基因組序列[19]中找到OmpH1和OmpH2的基因序列并轉碼為氨基酸。然后使用Clustal Omega（http://www.clustal.org/omega/）進行多序列比對，比較OmpH1和OmpH2蛋白質一級結構之間的相似性和差異。

1.3 OmpH2基因的克隆以多殺性巴氏桿菌 PMTB2.1菌株OmpH2的基因序列[19]為參考序列，設計克隆引物。使用SignalIP4.0找出信號肽對應基因序列并截去，進而設計引物OmpH2-F（5'-cagcaaatgggtcgcg gatccGCAACCGTTTTCGATAAAGAAGG-3'，小寫字母為與載體相同的同源臂，下同）和OmpH2-R（5'-gcaagcttgtcgacggagctcGAAGTGTACGCGTAAA CCAACACC-3'）。按照文獻[20]提取C51-17菌株基因組并進行PCR擴增。酶切質粒并通過同源重組克隆試劑盒（諾唯贊，南京）將OmpH2的PCR擴增片段連接到pET28a（+）上，將陽性重組質粒轉化BL21感受態(tài)細胞。經(jīng)PCR鑒定后，將陽性克隆送南京擎科生物科技有限公司測序。

1.4 誘導表達并鑒定對OmpH2重組大腸桿菌進行IPTG誘導表達。優(yōu)化誘導溫度，分別設置為37℃、28℃、16℃；優(yōu)化IPTG終濃度，分別設置為0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L。重組菌誘導表達后超聲波破碎，12000×g離心，分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE分析，檢測表達效果。

1.5 rOmpH2與多殺性巴氏桿菌感染康復血清的反應將rOmpH2進行SDS-PAGE并將蛋白轉到NC膜上，同時以紅斑丹毒絲菌SpaA重組蛋白為陰性對照，多殺性巴氏桿菌GAPDH重組蛋白為陽性對照，對照組重組蛋白已經(jīng)在以前的研究[15,17]中制備。經(jīng)過5%的脫脂乳封閉后，加入本實驗室保存的1/500稀釋的C51-17株的兔感染康復血清[21]，37℃孵育1 h；PBST漂洗5遍，加入1/5000稀釋的HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h； PBST漂洗5遍，進行ECL（諾唯贊，南京）顯色。

1.6 Fn和Plg結合活性檢測參照文獻[15]進行Far Western blot實驗。將重組rOmpH2進行SDS-PAGE并將蛋白轉到NC膜上。經(jīng)過5%脫脂乳封閉后，加入10 μg/mL人源Fn或 Plg（Sigma），37℃孵育2 h。對照組不與Fn及Plg進行孵育，但同樣進行后續(xù)操作。漂洗5遍，分別加入1/1000稀釋的兔抗人纖維連接蛋白抗體和兔抗人血漿纖維蛋白溶解酶原抗體，37℃孵育1 h。PBST漂洗5遍，加入1/5000稀釋的HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；PBST漂洗5遍，進行ECL（諾唯贊，南京）顯色。

1.7 rOmpH2多克隆抗體的制備將100 μg/50 μL純化的重組蛋白rOmpH2用等體積弗氏完全佐劑（Sigma）乳化后，以腹腔注射方式免疫5只小鼠，每只100 μL，14 d后，以100 μg/ 50 μL純化的重組蛋白同等體積弗氏不完全佐劑（Sigma）乳化后，采用皮下注射方式進行二次免疫。第二次免疫10 d后采血制備多克隆抗血清，并用蛋白A抗體純化試劑盒（金斯瑞，南京）純化出血清中的IgG。

1.8 Plg和Fn的招募抑制實驗參照文獻[22-23]進行實驗。以多殺性巴氏桿菌C51-17株包被ELISA板，108CFU/孔，4℃過夜；經(jīng)PBST洗滌3次，以5%脫脂乳37℃封閉1 h。以50 μL 1/10稀釋的OmpH2 IgG 37℃孵育0.5 h，并以1/10稀釋的免疫前血清IgG為對照，PBST洗滌3遍，分別與50 μL的纖維連接蛋白（100 ng）和血漿纖維蛋白溶解酶原（100 ng），37℃孵育1 h。洗滌后，每孔加入1/1000稀釋的兔源抗血漿纖維蛋白溶解酶原IgG或者1/1000稀釋的兔源抗纖維連接蛋白IgG，37℃孵育0.5 h；洗滌3次，加入1/5000稀釋的HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗，37℃孵育0.5 h。洗滌后，每孔加入100 μL TMB顯色液，室溫避光反應10 min后，加入終止反應液。在酶標儀上讀取450 nm的吸光度。以OmpH2 IgG處理組的OD值除以免疫前血清IgG處理組的OD值計算多殺性巴氏桿菌對Fn和Plg的相對結合活性。實驗重復3次，用t檢驗檢測實驗組和對照組的統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 OmpH2和OmpH1的氨基酸序列比對結果對OmpH2和OmpH1的氨基酸序列進行比對，其序列一致性為46.1%，相似性為78.2%。但是兩者存在若干高度相同或相似的局部區(qū)域（如OmpH2的L106～F148、L185～K204等），見圖1。

2.2 OmpH2重組蛋白的表達和純化將擴增的OmpH2的基因連接到pET28a（+）載體上，陽性菌株測序結果顯示C51-17株的OmpH2基因序列與GenBank上PMTB2.1株OmpH2基因序列一致性為100%。將重組質粒轉入BL21工程菌后，通過優(yōu)化誘導條件，選用37℃、0.6 mmol/L IPTG誘導表達，獲得較多的重組蛋白rOmpH2（～43 kDa），主要以包涵體形式表達（圖2A）。

2.3 rOmpH2與多殺性巴氏桿菌康復血清的反應Western blot結果顯示，多殺性巴氏桿菌OmpH2能夠與多殺性巴氏桿菌康復血清發(fā)生特異性反應。作為陰性對照的紅斑丹毒絲菌SpaA泳道未見符合預期大?。?0 kDa）的條帶，作為陽性對照的巴氏桿菌GAPDH（41 kDa）泳道和OmpH2（43 kDa）泳道均存在一條符合預期大小的條帶（圖2B）。

2.4 rOmpH2與Fn和Plg的結合活性針對Fn和Plg結合作用檢測的Far Western blot結果顯示，rOmpH2泳道上均存在一條約43 kDa的條帶，與rOmpH2大小一致，未孵育Fn或Plg的對照NC膜上未見符合預期大小的條帶（圖3），即rOmpH2具有結合Fn和Plg的能力。

2.5 rOmpH2多克隆抗體的Fn和Plg結合抑制作用ELISA結果顯示，rOmpH2 IgG孵育處理后，多殺性巴氏桿菌對于Fn和Plg的結合能力顯著下降。經(jīng)過rOmpH2 IgG孵育后多殺性巴氏桿菌對Fn和Plg的結合能力均顯著下降，分別下降了30%、20%左右（圖4）。

圖1 OmpH1和OmpH2一級結構的比較Fig.1 Comparison of primary structure of OmpH1 and OmpH2

圖2 重組rOmpH2蛋白的表達及與康復血清的反應Fig.2 Recombinant expression of rOmpH2 and its reactivity with recover serum

3 討論

孔蛋白OmpH是多殺性巴氏桿菌的一種主要的外膜蛋白，具有2個拷貝的基因[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)OmpH1在巴氏桿菌致病機制中發(fā)揮黏附作用[12-13]。盡管OmpH2與OmpH1的氨基酸序列存在一定差異，但是它們之間存在高度相似的局部區(qū)域，因而OmpH2可能也具有類似的功能，因此我們對OmpH2的黏附作用開展了研究。

病原菌免疫原性較好的分子也常常在其致病過程中發(fā)揮作用[24-25]。本研究首先表達了多殺性巴氏桿菌的rOmpH2蛋白，并對其致病機理展開了初步研究。Western blot表明，rOmpH2與多殺性巴氏桿菌高免血清存在明顯的反應。這一結果與另一個團隊的檢測結果一致[14]，表明OmpH2可能在多殺性巴氏桿菌感染與免疫反應中發(fā)揮重要作用。

Fn是細胞外基質的重要組成成分。很多病原菌通過結合該分子實現(xiàn)對宿主細胞的黏附進而發(fā)揮致病作用[26]。結合Fn同樣也是多殺性巴氏桿菌黏附宿主細胞的重要途徑[27]。但是Fn增強多殺性巴氏桿菌黏附的分子機制還不完全清楚。Plg是動物體內重要的黏附分子，有多個可以與其他分子發(fā)生結合的結構域。很多病原菌通過結合Plg增強對宿主細胞的黏附作用[25,28]。本實驗室前期報道了多殺性巴氏桿菌能夠利用Plg[29]。本研究發(fā)現(xiàn)rOmpH2能夠結合Fn和Plg，而且rOmpH2多克隆抗體能夠顯著抑制多殺性巴氏桿菌對Fn和Plg的結合。因此，OmpH2還可能在多殺性巴氏桿菌結合細胞外基質成分Fn和宿主Plg過程中發(fā)揮作用，進而促進多殺性巴氏桿菌對宿主細胞的黏附作用。

圖3 Far Western blot檢測rOmpH2對宿主Fn和Plg分子的結合作用Fig. 3 Detection of binding activity of rOmpH2 to host Fn and Plg via Far Western blot

圖4 OmpH2多克隆抗體對多殺性巴氏桿菌黏附宿主Fn和Plg的抑制作用Fig. 4 Inhibition activity of OmpH2 polyclonal antibodies to binding activity of P. multocida to host Fn and Plg