蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)研究現(xiàn)狀與方向

徐顥溪劉 磊

（1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，安徽 合肥230026；2.安徽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 合肥230011）

蛋白質(zhì)是生物的生命進程中的主要功能性大分子物質(zhì)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)即利用蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的解析來分析蛋白質(zhì)生物學(xué)功能，并進一步研究生物體生命活動分子機制[1]。故解析蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)是日前較為熱門的研究方向?，F(xiàn)階段對蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的解析方法主要有較為傳統(tǒng)的核磁共振技術(shù)（nuclear magnetic resonance）、X射線晶體衍射法（Xray crystalline diffraction）以及近期研究較多的冷凍電鏡技術(shù)（Cryo-Electron Microscopy）[2]等。

一、X射線晶體衍射法

自從1895年倫琴發(fā)現(xiàn)X射線后，物理學(xué)家們就開始探索X射線的特性及其應(yīng)用方向[3]。在1934年，貝爾納和克勞福特得到了第一張蛋白質(zhì)（胃蛋白酶）晶體的X射線衍射圖片。1953年，蛋白質(zhì)晶體學(xué)家佩魯茨通過將重金屬粒子引入蛋白晶體里，進行同晶置換來解決蛋白晶體X射線衍射相位問題，提出了蛋白質(zhì)晶體分子結(jié)構(gòu)可測定型的理論基礎(chǔ)，并進行了低分辨率的蛋白晶體衍射解構(gòu)[4]。歷史上，用X射線晶體衍射法第一個測定蛋白質(zhì)大分子結(jié)構(gòu)并對其分子結(jié)構(gòu)進行解釋的是布萊克和菲利普斯，他們分別測出了溶菌酶的三維空間結(jié)構(gòu)并解釋了其分子作用機理[5]。后期，X射線大多由同步輻射光源產(chǎn)生。

X射線衍射法測定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)時，需要先對目標(biāo)蛋白進行純化及結(jié)晶。解析蛋白晶體結(jié)構(gòu)所涉及的X射線波長約為1A?，這是因為蛋白晶體結(jié)構(gòu)中的分子均為規(guī)律性分布，且晶體內(nèi)原子間的距離與此波長范圍的數(shù)量級相同[6]。當(dāng)光打到蛋白晶體上，蛋白晶體內(nèi)每個原子都產(chǎn)生次生射線相互疊加且干涉，且形成強X射線衍射成像。其晶體衍射狀況和晶體自身結(jié)構(gòu)相關(guān)，具備強烈的規(guī)律性及特征性。其衍射強度與單位晶胞中的重金屬原子排列周期及方式等特性相關(guān)，衍射的方向和單位晶胞的大小及形狀等相關(guān)[7]。人們利用晶體中衍射位點的間距及排列分析蛋白晶體結(jié)構(gòu)的排列規(guī)律及方式，并通過計算機輔助計算，利用衍射強度的不同，分析蛋白空間結(jié)構(gòu)中單個原子的坐標(biāo)位點[8]，以此解構(gòu)蛋白晶體。

二、核磁共振技術(shù)

核磁共振包括固相和液相技術(shù)，其最大特點是液相核磁共振技術(shù)。固相核磁共振技術(shù)主要用于不可溶蛋白結(jié)構(gòu)，而液相核磁共振技術(shù)的應(yīng)用更為廣闊，它可以在液相環(huán)境中，在各類如溫度、離子濃度及pH值等因素接近生理條件情況下，對蛋白進行解構(gòu)。1978年，核磁共振技術(shù)首次被用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析，獲得首個高分辨率病毒衣殼蛋白三維結(jié)構(gòu)（西紅柿叢矮病毒）[9]；在2008年，利用固體核磁共振技術(shù)輔助電子顯微鏡，科學(xué)家獲得了β片層結(jié)構(gòu)的淀粉樣纖維蛋白的完整結(jié)構(gòu)，此蛋白與阿爾茨海默病關(guān)聯(lián)緊密，有助于人們對此病癥分子機理及診療手段的研究[10]；核磁共振技術(shù)中取得重要進展領(lǐng)域之一是通過核磁共振技術(shù)無損獲得細(xì)胞中分子結(jié)構(gòu)信息，2009年，有研究顯示,核磁共振技術(shù)展示了泛素在細(xì)胞內(nèi)外質(zhì)子交換速率之差，以及細(xì)胞中蛋白FKBP12與免疫抑制劑相互作用方式[11]，令人類社會進一步了解了分子及原子水平中生物大分子功能，以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。

在應(yīng)用液相核磁共振技術(shù)對蛋白結(jié)構(gòu)進行研究的過程中，首先需要通過同位素對蛋白樣品進行標(biāo)記，主要是在培養(yǎng)基中利用15N對氮源標(biāo)記、利用13C對碳源標(biāo)記，用同位素標(biāo)記的碳源或氮源為唯一碳素或氮素的來源。通過核磁共振技術(shù)處理后，需要指認(rèn)核磁共振譜圖上的化學(xué)位移，即得到蛋白結(jié)構(gòu)中可形成核磁共振記號的每個原子化學(xué)位移的數(shù)值。包括主鏈上及側(cè)鏈上每個原子的化學(xué)位移。化學(xué)位移指認(rèn)可通過主鏈試驗HNCA、HN（CO）CA等或側(cè)鏈特殊實驗（HB）CB（CGCD）HD等確認(rèn)[12]。正確選擇原始結(jié)構(gòu)是后續(xù)步驟的重要基礎(chǔ)，通過一些自動化軟件，如CYANA中的CANDID軟件包，或ARIA等[13]，確認(rèn)NOE約束歸屬而獲得粗糙的蛋白原始折疊空間構(gòu)像。在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究，獲得其結(jié)構(gòu)約束，進一步通過如ANSO、SANE、Xplor-NIH或CYANA等軟件計算結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)確認(rèn)后最后通過如AMBER、CHARMM以及INSIGHT等模擬分子動力學(xué)的軟件進行蛋白結(jié)構(gòu)的精修。

三、冷凍電鏡技術(shù)

冷凍電鏡技術(shù)，即冷凍電子顯微鏡技術(shù)[14]，通過將樣品迅速冷凍固定于玻璃態(tài)不定型溶液里，用透射電鏡在低溫條件下顯像，再通過圖形處理及后期計算解析樣品空間結(jié)構(gòu)。此法具有樣品無須結(jié)晶、可研究的生物分子跨度達到12個量級、所需樣品量少、樣品分辨率已至（近）原子水平等優(yōu)點，突破了研究生物大分子的各類難題。近幾年，冷凍電鏡技術(shù)的長足發(fā)展一是來自硬件的更新——DDD（Direct electron detector，自接電子檢測相機）的出現(xiàn)，DDD具備高分辨的成像裝備，能直接檢測電子[15]；二是來源于圖形圖像處理軟件的進步，可分辨較低分子量的小分子蛋白和細(xì)胞器，并可對于樣品漂浮而產(chǎn)生的偏差進行糾正。

冷凍電鏡技術(shù)包括了樣品分離純化、電鏡樣品的制備、蛋白數(shù)據(jù)搜集及處理等步驟。冷凍電鏡中所需樣品純度需為90%至95%以上，對于純化較困難的蛋白樣品，后期可進行軟件數(shù)據(jù)模擬純化以區(qū)別不同狀態(tài)樣品。制備電鏡樣品時，通過液氮冷卻的乙烷將含水樣品速凍，將水分子轉(zhuǎn)為玻璃態(tài)非晶體冰，樣品懸浮于其中，用于減少電子輻射，保持其天然構(gòu)像[16]。然后通過電鏡進行數(shù)據(jù)的收集，數(shù)據(jù)的收集量來源于被測蛋白樣品的均一性、分辨率、對稱性及成像質(zhì)量等，對于均一性差、分辨率差以及不對稱分子通常需要采集大量粒子數(shù)據(jù)，約收集5到15萬個數(shù)據(jù)才可達到近原子分辨率。粒子數(shù)據(jù)收集后需要進行進一步的處理，首先要先確定粒子的參數(shù)，每個粒子圖需確定5類參數(shù)，分別為平移的自由度X和Y（兩個平面中）、旋轉(zhuǎn)的自由度α及β（兩個離開平面中）和γ（一個平面中）[17]，其中從旋轉(zhuǎn)的自由度獲得了粒子空間三維數(shù)據(jù)，利用對位可消除一個平面中的自由度，可通過重構(gòu)軟件SPIDER、XMIPP及EMAN2等的計算用以確認(rèn)每個粒子相關(guān)參數(shù)。然后，根據(jù)K均值聚類等算法進行二維分類，用以估算粒子分布及取向、粒子數(shù)據(jù)質(zhì)量等，二維分類后通過中心截面原理利用共價線、RCT等方法重構(gòu)樣品的空間三維結(jié)構(gòu)，而后進行三維分類和模型的精修。三維分類可確認(rèn)不同粒子的空間取向、空間構(gòu)像及組成和結(jié)構(gòu)等，而獲取高分辨率空間結(jié)構(gòu)，常用FREALIGN和RELION軟件[18]。對模型進行精修時，可利用投影匹配的方法進行比對，最終大幅度提高物質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的分辨率。最后通過FSC曲線對分子結(jié)構(gòu)的分辨率進行評估，通常分辨率在15A?以上，可分辨蛋白亞基的分界線；分辨率在10A?以上可辨認(rèn)二級結(jié)構(gòu)密度；分辨率在4A?以上可分辨蛋白主鏈；當(dāng)分辨率在3A?左右，即可辨別氨基酸殘基側(cè)鏈基團等[19]。

四、未來方向發(fā)展

蛋白結(jié)構(gòu)解析技術(shù)對于蛋白分子的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及其生理特性的了解和應(yīng)用具有重要的意義[20]。近年來，多種蛋白結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的并行發(fā)展，同樣對結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展發(fā)揮了重要的作用。

X射線晶體衍射法較為主流和經(jīng)典，2009年世界上第一臺X射線自由電子激光裝置建成[21]，自由電子激光形成的射線是具備短時間高強度的脈沖，對不能結(jié)晶的蛋白結(jié)構(gòu)、超小晶體以及受損晶體可獲得衍射成像，使人們對生物大分子結(jié)構(gòu)通過X射線衍射法的解析方式有了另一種不同且全新的理解，在RCSB Protein Data Bank中通過X射線晶體衍射法解析的蛋白結(jié)構(gòu)占比約88%。但依賴于大分子晶體的制備，對于許多無法結(jié)晶的物質(zhì)存在著結(jié)構(gòu)的難度。利用同步輻射光源解析的主要是靜態(tài)或者微動態(tài)蛋白晶體結(jié)構(gòu)，利用X射線自由電子激光解析的則是ps甚至fs量級的蛋白動態(tài)空間構(gòu)型[22]，被認(rèn)為有可能為生物大分子解構(gòu)方式帶來大跨步的躍進。

核磁共振技術(shù)可獲得蛋白的靜態(tài)和動態(tài)結(jié)構(gòu)，在20世紀(jì)末期，只有相對分子質(zhì)量較?。ǎ?5k）的蛋白空間結(jié)構(gòu)可通過核磁共振技術(shù)解構(gòu)[23]。后因核磁共振設(shè)備的不斷更新，以及新的核磁脈沖和蛋白標(biāo)定技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，核磁共振技術(shù)以及可以解構(gòu)的蛋白已遠(yuǎn)大于25k，甚至可解構(gòu)超大蛋白，如分子量大小為幾十萬的蛋白空間結(jié)構(gòu)。不光如此，液體核磁共振技術(shù)更大的優(yōu)越性表現(xiàn)在可解構(gòu)蛋白分子在溶液環(huán)境中的動態(tài)結(jié)構(gòu)，它可利用核磁弛豫現(xiàn)象研究原子水平下的多位點的蛋白動力學(xué)性質(zhì)。在生物體中，蛋白大多具備功能性，故靜態(tài)空間結(jié)構(gòu)的解構(gòu)往往不能完全反映蛋白功能性，故蛋白動態(tài)結(jié)構(gòu)的解析是對于蛋白生物學(xué)活性研究的關(guān)鍵一環(huán)。近些年核磁共振技術(shù)發(fā)展到可研究更高分子量的蛋白大分子的動態(tài)結(jié)構(gòu)，如選擇性標(biāo)記或氘代樣品制備[24]，可獲得更多長程約束，提高解構(gòu)質(zhì)量，如TROSY（Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy，橫弛豫優(yōu)化脈沖）的出現(xiàn)，可指認(rèn)化學(xué)位移及解析解構(gòu)[25]。但多測定的為分子量較小的大分子類物質(zhì)，可解析的蛋白結(jié)構(gòu)有限。故核磁共振技術(shù)，特別是液相技術(shù)可研究蛋白動態(tài)結(jié)構(gòu)、功能及其動力學(xué)特性，有其獨到之處，雖然如此，但由很多實驗技術(shù)還不夠成熟，不具備普適性，還需要繼續(xù)分析和改進。

最近發(fā)展迅猛的冷凍電鏡技術(shù)，可測定非晶體生物大分子類物資，通過冷凍電鏡技術(shù)可利用其高分辨率能觀察到小分子物質(zhì)、解析小分子蛋白以及不對稱樣品等[26]。冷凍電鏡對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的發(fā)展在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域做出重要貢獻。20世紀(jì)末，因冷凍電鏡對生物對稱性樣品特有的高度解析性，張景強得到了分辨率僅為0.8nm的家蠶質(zhì)多角體病毒，在病毒蛋白結(jié)構(gòu)研究及針對病毒致病機制對應(yīng)藥物研制方面功不可沒[27]；清華大學(xué)研究團隊在2016年第一次利用冷凍電鏡獲取了線粒體中呼吸鏈超級復(fù)合蛋白空間結(jié)構(gòu)，指明了以其為靶向物質(zhì)藥物的研究方向[28]；中國科學(xué)院生物物理研究所李國紅和朱平研究組合作獲得了30nm染色質(zhì)左手雙螺旋高分辨率三維結(jié)構(gòu)[29]，有助人類對癌癥等病癥分子機制研究，并為人類基因組計劃做出了重要貢獻。同時冷凍電鏡技術(shù)伴隨著人類社會對生命科學(xué)領(lǐng)域研究的重視而逐漸發(fā)展起來，清華大學(xué)王宏偉研究組于2017年首次提出且利用冷凍電鏡成像理論新方法過焦成像技術(shù)得到高分辨蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)[30]。2018年浙江大學(xué)冷凍電鏡中心首次解析了蛋白質(zhì)原子分辨率結(jié)構(gòu)[31]，2020年，德國馬克斯普朗克生物物理化學(xué)研究所研究團隊和英國劍橋大學(xué)研究團隊利用冷凍電鏡技術(shù)分別解析了至今為止最為清晰的原子級分辨率的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并首次識別出蛋白分子中單個原子位置[32]。冷凍電鏡技術(shù)及方法已逐漸成熟，迅猛發(fā)展，但對晶體類蛋白的應(yīng)用場景卻有所不足。

總之，各類蛋白解析技術(shù)有其優(yōu)點，也有其缺點。在后續(xù)研究發(fā)展中，需將多種結(jié)構(gòu)解析技術(shù)結(jié)合而有利于各類難以解構(gòu)的蛋白之謎被解析，并進行更深層次的探討及蛋白性質(zhì)及功能的應(yīng)用。