子宮頸癌篩查方法的研究進展

卜相冉，王 炯

(長治醫(yī)學院附屬和濟醫(yī)院婦科，山西 長治 046011)

子宮頸癌是威脅全世界女性健康和生命的主要惡性腫瘤之一，發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第四位，世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全球每年子宮頸癌新發(fā)病例52.9萬,死亡病例約27萬,其中90%以上來自發(fā)展中國家[1]。中國作為最大發(fā)展中國家，2015年新發(fā)病例10.64萬例，占全世界的15.4%，死亡病例4.77萬例[2]。在中國，15歲～44歲女性中子宮頸癌的發(fā)病率位居第二位，僅次于乳腺癌，死亡率位居第三位[3]。子宮頸癌的發(fā)生和人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)有著千絲萬縷的聯(lián)系，99.7%的子宮頸癌中可檢測出HPV，自1995年國際癌癥研究中心專題討論會指出高危型持續(xù)感染是發(fā)生子宮頸癌的首要因素而且為始動因素[4]。然而，從感染HPV發(fā)展至宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變進而發(fā)展為浸潤癌一般會歷時10年～20年，在這個漫長的過程中，90%以上的感染會被機體自身免疫清除[5]，不能被自體免疫清除的病毒，便可以通過現(xiàn)有的篩查方法識別有可能發(fā)展為浸潤癌的癌前病變，并運用現(xiàn)有的醫(yī)療技術治療宮頸高級別病變，從而避免或阻斷其進一步發(fā)展為浸潤癌，達到治愈子宮頸癌的目的。本文對目前常用和不常用的子宮頸癌的篩查方法進行綜述，為臨床選擇恰當?shù)暮Y查方法提供理論支持。

1 肉眼觀察法

肉眼觀察法包括醋酸染色法(VIA)和碘染色法(VIAI)。VIA和VILI法均用生理鹽水棉球擦拭宮頸后將5%醋酸/5%碘液均勻地涂布于子宮頸表面，待1 min后在普通光源下觀察子宮頸的變化。VIA法病變區(qū)域顯示白色，根據(jù)白色病變的厚薄、邊界、輪廓、是否有鑲嵌及其消失的速度等做出初步診斷。結果可分為陰性、陽性和可疑癌。VILI法子宮頸上皮呈現(xiàn)棕褐色為正常，未著色呈現(xiàn)芥末黃色為病變。根據(jù)未著色的程度、表面形態(tài)、邊界狀況及與鱗柱交界的距離作出初步診斷。結果可分為陰性、陽性和可疑癌。

近年來，VIA技術日益完善，利用葉酸受體進行上皮組織染色成為該病的新型篩查方法，其通過特殊染色法，能夠在病理學的檢測報告出具前初步篩查出宮頸管內(nèi)與宮頸表面的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅱ級以上病變[6]。VIA和VILI法均用于子宮頸癌篩查，方法簡捷、容易操作、檢查費用經(jīng)濟、培訓簡單、即查即出結果，不需要等待，適合經(jīng)濟不發(fā)達、醫(yī)療資源匱乏的地區(qū)。有文獻報道，通過視覺篩查有50%的子宮頸癌可以在早期階段(Ⅰ～Ⅱa期)檢測到。2007年，在印度開展的一項大樣本隨機對照試驗研究證明在發(fā)展中國家可將VIA和VILI作為有效的子宮頸癌的篩查方法[7]。但其靈敏度和特異度較低，對子宮頸癌患者不能進行詳細分期，后期治療也就不能給予明確的指導，被逐漸優(yōu)化的篩查方法所取代也是大勢所趨。

2 細胞學檢測法

細胞學檢測方法包括巴氏細胞涂片法及改良后的薄層液基細胞學檢查(TCT)、DNA倍體定量分析檢測法。

2.1 巴氏細胞涂片法

1941年美國Papanicolaou提出巴氏細胞涂片和染色法(巴氏涂片)，此法是過去70多年來子宮頸癌篩查的主要手段，在降低子宮頸癌的發(fā)病率方面發(fā)揮了重要作用。具體操作過程：暴露子宮頸，將子宮頸刮板置于子宮頸外口，將子宮頸刮板輕輕旋轉，將刮出物均勻涂布于玻片上，95%乙醇固定30分鐘后行巴氏染色，觀察玻片上染色情況，其診斷標準按照巴氏分類法，可分為五級，Ⅰ級：正常，為正常宮頸細胞涂片；Ⅱa級：炎癥，細胞核增大，核染色質較粗，染色質分布尚均勻，屬良性改變或炎癥；Ⅱb級：個別細胞核異質明顯，但不支持惡性；Ⅲ級：可疑癌，有核異質，核大深染，核形不規(guī)則或雙核或性質不明細胞；Ⅳ級：高度可疑癌，細胞有惡性的特征，但涂片中惡性細胞較少；Ⅴ級：可確定為癌，細胞具有典型的多量癌細胞。但巴氏涂片法存在細胞堆積、雜質多、取不到病變細胞、圖像質量差等因素，容易影響檢查結果的判讀，假陰性率較高，多個臨床研究顯示，巴氏涂片用于子宮頸癌篩查的敏感性僅有51%(30%～87%),特異性也較低，容易造成部分患者漏診或誤診，影響醫(yī)療質量[8],加之傳統(tǒng)的巴氏五級分類法已無法適應現(xiàn)代臨床細胞學要求，已逐漸被新的篩查方法所取代。

2.2 薄層液基細胞學檢查(TCT)法

2.2.1 方法 ①檢查前，非經(jīng)期、禁性生活72 h、無陰道沖洗及上藥。②檢查時，暴露子宮頸，用“細胞刷”置于子宮頸管內(nèi)旋轉數(shù)圈采集子宮頸管、子宮頸外口脫落細胞。③將子宮頸“細胞刷”貯存于裝有保存液的標本瓶內(nèi)，充分搖勻。④制作薄層液基細胞涂片，95%乙醇固定、染色。⑤顯微鏡下觀察+計算機輔助閱片。

2.2.2 結果判斷使用TBS(the Bethesda system)分類法進行描述性診斷 (1)未見上皮內(nèi)病變細胞或惡性細胞(NILM)；(2)上皮細胞異常，包括鱗狀上皮細胞異常、腺細胞異常和其他惡性腫瘤。鱗狀上皮細胞異常有：①不典型鱗狀細胞(atypical squamous cells，ASC)包括無明確診斷意義的不典型鱗狀細胞(atypical squamous cell of undetermined significance，ASCUS)和不能排除高級別鱗狀上皮內(nèi)病變不典型鱗狀細胞(atypical squamous cells-cannot exclude HIS，ASC-H)；②低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL)：與CIN Ⅰ術語符合；③高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)：包括CINⅡ、CINⅢ和原位癌；④鱗狀細胞癌：若能明確組織類型，按下述報告：角化型鱗癌，非角化型鱗癌，小細胞型鱗癌；腺細胞異常主要有下列情況：①不典型腺上皮細胞(AGC)：包括宮頸管細胞AGC和子宮內(nèi)膜細胞AGC；②腺原位癌(AIS)；③腺癌：若可能，可判斷來源于宮頸管、子宮內(nèi)膜或子宮之外；其他惡性腫瘤包括原發(fā)于宮頸和子宮體的不常見腫瘤及轉移癌。

該方法彌補了巴氏細胞學五分類法的不足，提高了涂片的質量及對子宮頸癌診斷的準確度，降低了假陰性率，但該方法獲得的結果過分依賴于病理醫(yī)師的經(jīng)驗及技術水平，主觀性較強，導致結果誤差較大，再者TCT僅能發(fā)現(xiàn)細胞核形態(tài)學已經(jīng)發(fā)生改變的病變，不能有效的盡早地發(fā)現(xiàn)癌前病變[7]。

2.3 DNA倍體定量檢查方法

檢查前禁忌同上，取截石位,窺陰器暴露宮頸，用無菌棉球將宮頸口處的分泌物拭掉。將一次性宮頸刷沿患者的陰道送至其宮頸內(nèi)，沿順時針方向旋轉宮頸刷5圈。緩慢從患者的陰道內(nèi)取出宮頸刷，放入準備好的細胞保存液中。振蕩盛裝細胞保存液的瓶身，使宮頸刷頭完全浸沒在細胞保存液中。將盛裝細胞標本的瓶身密封好后，立即將其送至檢驗室。對每張DNA染色片(FEULGEN染色)上所有細胞核均采用全自動細胞圖像分析系統(tǒng)進行掃描(每張載玻片掃描5000個以上細胞核)，并測定細胞核積分光密度值(IOD)與核面積，分析DNA指數(shù)(DNAINDEX，DI)，自動完成細胞的分類和計數(shù)(根據(jù)不同細胞核所具有的不同特征參數(shù))，將同一張載玻片上的100個正常的上皮細胞作為標準對照，DI值為被測細胞IOD跟正常細胞IOD的比值。診斷標準：以DNA指數(shù)(DI)為指標，正常者，DI值為1～2(2C～4C細胞)，一般以2C作為標準對照細胞，DI≥2.5為DNA異常倍體(≥5C細胞)細胞。細胞DNA倍體定量結果分析判斷：①未見DNA異常倍體細胞；②可見少量DNA異常倍體細胞：檢出1～2個異常倍體細胞；③可見DNA異常倍體細胞：≥3個異常倍體細胞。細胞中的DNA改變與腫瘤發(fā)生具有相關性，若異倍體細胞發(fā)生染色體數(shù)量或結構變化，則說明細胞出現(xiàn)早期惡變特征。這種篩查方法通過流式細胞儀測量脫落細胞的DNA含量，提供了細胞學中異常非整倍體細胞的定性信息和存在性?？勺鳛榧毎麑W篩查的一個有用參數(shù)，且具有良好的特異性和敏感性[9]。通過參數(shù)分析能夠較早識別患者已經(jīng)發(fā)生病變的細胞，就能給予早期治療，從而提高子宮頸癌患者的生存率。DNA倍體定量分析對子宮頸癌的早期診斷是目前較理想的新技術，可明顯提高敏感性，降低漏診率，有利于子宮頸癌的早期診斷早期治療[10]。

3 人乳頭瘤病毒相關檢測法

高危型HPV持續(xù)感染是子宮頸癌前病變及子宮頸癌的主要致病因素。HPV檢測方法主要有：第二代雜交捕獲(Hybridcapture2，HC2)、酶切信號放大法(Cervista)、HPV快速篩查法(care HPV)、實時熒光定量PCR法(Cobas 4800 HPV)、Aptima HPV E6/E7表達檢測法。

3.1 第二代雜交捕獲2代技術(HC2)

HC2是利用信號放大的酶標板技術和化學發(fā)光檢測法的核酸雜交檢測方法對13種高風險型HPV和5種低風險型HPV在分子水平進行定性和半定量檢測法[11]。具體操作：取截石位，暴露宮頸，用無菌棉棒擦拭宮頸口分泌物，將專用HPV刷置于宮頸口與粘膜交界處，沿同一方向旋轉3～5周，取出刷子，將其置于裝有特定保存液的標本瓶內(nèi)，立即送至檢驗科進行分析檢測。第二代雜交捕獲法檢測是非放射性檢測技術,其陰性預測值高，靈敏度和特異性均較高[12]，而且操作簡單，結果客觀，不受人為和環(huán)境因素影響，重復性好。有研究顯示，HC2單獨檢測的敏感度及特異度優(yōu)于TCT單獨檢測，但由于該方法對檢測儀器要求較高，檢查費用昂貴，結果受取樣量和宮頸病變程度等因素的影響，假陽性率較高，不能對HPV進行精確分型，并且也無法準確判斷宮頸病變的程度，常與細胞學篩查方法聯(lián)合應用。

3.2 酶切信號放大法(Cervista)

酶切信號放大法是由美國HOLOGIC公司開發(fā)，被美國FDA批準應用于臨床檢測HPV DNA的專利技術。先使用高危型人乳頭狀瘤病毒酶切信號放大法(Cervista HPV HR)不分型檢測試劑盒檢測HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68等14種高危型HPV，Cervista HPV HR檢測結果為陽性的標本，再用Cervista HPV16/18分型檢測試劑盒行HPV16和HPV18分型檢測。檢測過程:①Cervista DNA的提取;②Cervista檢測信息的錄入;③Cervista高危型HPV檢測;④熒光閱讀儀的讀數(shù);⑤結果分析判斷。該技術對所檢查的14種高危型HPV DNA具有較高的敏感性和特異性，對子宮頸癌前病變的陰性預測值也較高[13]。有學者研究認為Cervista同HC2、以及多色熒光雜交技術、實時熒光定量PCR技術、PCR反向點雜交技術檢測結果一致性良好,都是檢測HPV的有效手段。但病毒是否處于感染階段及病毒是否致癌，該方法無法進行判斷，容易導致過度醫(yī)療，同時也增加了對HPV不是很了解的患者的焦慮和擔憂，且其特異性較差，容易誤診，尤其對30歲以下的年輕女性危害更大[14]。

3.3 Care HPV

Care HPV是一種簡單、快速、廉價的HPV DNA檢測技術，在經(jīng)濟欠發(fā)達和醫(yī)療資源貧乏地區(qū)子宮頸癌防治領域中具有廣闊的應用前景[15]。2014年中國山西省襄垣縣作為試點之一首先引進該項技術。Care HPV技術原理是利用核酸雜交和信號擴大的方法，捕獲HPV DNA并產(chǎn)生化學光對14種高危型HPV(HPV16，18,31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)進行檢測。其體位和子宮頸暴露情況與上述兩種方法相同，使用專門取樣器在宮頸口處取材，沿同一方向旋轉6周并停留10s，將取出的樣本置于保存液中后立即送至檢驗科，采用Care HPV方法進行檢測。Care HPV篩查技術的靈敏度和特異性分別可達到90.0%和84.2%，接近HC2技術，但費用僅為其1/10[16]。該方法操作簡便，設備簡單，試劑保存不需要特殊條件，對專門技術人員培訓簡單，出結果迅速。因此該方法適合用于經(jīng)濟不發(fā)達國家及醫(yī)療條件匱乏的地區(qū)。

3.4 Cobas 4800(實時熒光定量PCR法)

Cobas 4800檢測技術:①樣本制備:自動化提取HPV和宿主細胞DNA。②擴增檢測:分別采用與HPV和β球蛋白特異性互補的引物及熒光標記特異性寡聚核酸探針，通過實時熒光定量PCR對靶序列進行擴增檢測。Cobas 4800檢測結果主要基于四種不同的熒光染料標記的寡核苷酸探針對靶序列進行監(jiān)測，這四種熒光染料分別用于檢測12種高危型HPV(31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)、HPV16、HPV18和β-球蛋白。β-球蛋白是整個檢測過程的內(nèi)標(internal control，IC)，最終檢測結果以擴增反應的循環(huán)數(shù)(Ct值)表示，根據(jù)系統(tǒng)自帶的分析軟件實現(xiàn)定性檢測。該方法可同時檢測14種高危型HPV。實時熒光定量PCR技術從根本上解決了PCR擴增產(chǎn)物被污染和不能定量的問題[17],具有快速簡便、靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。其不會與低危型HPV發(fā)生交叉反應，與HC2相比，其檢測范圍更為廣泛，特異性更強，對于HPV16/18的辨別性高，應用前景較為廣闊[18]，但研究表明，單獨行高危型HPV檢測仍然有較高的漏檢率，不利于子宮頸癌的精準篩查。

3.5 Aptima HPV E6/E7表達檢測法

美國FDA已于2012年批準了全球第一個基于E6、E7 mRNA的高危型HPV檢測試劑盒-Aptima HPV[19]。E6和E7基因首先轉錄大量的E6、E7 mRNA，然后再由mRNA翻譯成相應的致癌蛋白，該蛋白通過降解抑癌蛋白p53和視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(pRb)失活使被感染的細胞可無限增殖并惡性轉變，所以E6、E7 mRNA的大量表達是細胞發(fā)生高級別病變的一個信號。此方法采用支鏈DNA技術測定所有患者HPV E6/E7 mRNA的表達情況。采用一次性宮頸采樣刷收集宮頸脫落細胞，放置于細胞保存液中并立即送檢。結果判定：拷貝數(shù)≥1 copy/mL為檢測陽性(+)，反之為陰性(-)。前四種一代HPV DNA檢測方法,敏感性較高，但特異性較低，此種檢測方法進一步減少了對一過性HPV感染的檢出，減少了假陽性率，具有更高的臨床特異性,這對于早期發(fā)現(xiàn)子宮頸癌前病變有重要價值。

4 陰道鏡聯(lián)合宮頸活組織病理檢查

4.1 檢查方法

患者檢查前禁止性生活,檢查前3天內(nèi)確保無陰道沖洗或上藥等,檢查時間確定在月經(jīng)干凈3～7天后,行陰道鏡檢查。①觀察。觀察外陰、陰道、宮頸，先行子宮頸生理鹽水實驗，為了避免醋酸作用不充分而影響結果判讀，用3%～5%的醋酸浸泡1 min后再進行觀察；②定位。涂碘溶液定位；③再觀察。病變部位放大10～40倍，觀察其血管與上皮病變，區(qū)分鱗柱上皮與轉化區(qū)；④取樣。為便于了解病變范圍，對可疑者行病理活檢。

4.2 診斷標準

異常陰道鏡可見子宮頸不典型轉化區(qū)與可疑浸潤癌,不典型轉化區(qū)包括醋酸白色上皮、白斑、點狀血管、異型血管及鑲嵌。醋酸不著色為陽性，可見白色上皮，邊界模糊，擬診為子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(CINI)；白色上皮，邊界較清，可見子宮頸鱗柱上皮交界轉化區(qū)，擬診為CIN Ⅱ；白色上皮，邊界清楚，可見增粗點狀血管，涂碘不著色，擬診為CIN Ⅲ。出現(xiàn)復雜圖形，如異形血管、豬油樣改變或巖石狀突起等為浸潤癌[7]。

該方法將病變部位放大，便于發(fā)現(xiàn)微小病變，結合子宮頸活組織病理檢查，可以精確取材，有較高的診斷率。但該方法不能檢查到宮頸管內(nèi)的病變，而且絕經(jīng)期女性子宮頸鱗柱上皮交界區(qū)萎縮上移，也為診斷帶來一定難度，此方法在一定程度上還受檢查醫(yī)師的技術水平影響，造成一定的漏診率。

5 分子標志物相關檢測

生物標志物檢測聯(lián)合細胞形態(tài)學篩查可更準確地發(fā)現(xiàn)子宮頸高級別病變，從而及時采取干預措施，達到一級預防目的。迄今為止，研究較多的是抑制蛋白p16INK4A(p16)、增殖細胞相關核抗原Ki-67等。p16作為一種抑癌基因，其失活后能夠引起宿主細胞無限生長。Ki-67能夠加快腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并反映腫瘤細胞的增殖速度，且其表達水平越高，說明病變程度越高。只有p16/Ki67雙染均陽性，才提示宮頸HPV持續(xù)感染。2015年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會的子宮頸癌篩查過渡期指南中指出HR-HPV篩查的靈敏度高于細胞學，但特異性不滿意。p16/Ki67雙染是近年來新出現(xiàn)的子宮頸病變檢出手段，該方法減少了篩查中對細胞學檢測方法的依賴。如果同一細胞中檢測到p16和Ki67共表達，可作為細胞周期失調的標志物，強烈提示子宮頸高級別病變[20-21]。

6 小結與展望

子宮頸癌是威脅女性健康的第二大“殺手”，但其是可以通過早預防、早診斷、早干預就能扼制的惡性腫瘤。2017年HPV疫苗在我國大陸正式上市，但疫苗接種并不理想，全民對HPV的認識度不高，為了讓人們更好的認識HPV防治知識，由國際乳頭瘤病毒學會(IPVS)發(fā)起，從2018年起，每年的3月4日都被定為了“國際HPV知曉日(HPV Awareness Day)”，到現(xiàn)在已有三個年頭。作為醫(yī)生除了宣傳，最重要的是要做好癌前病變的篩查工作，守住癌前的最后一道防線。子宮頸癌的篩查方法從細胞學檢查到HPV檢測，再到近幾年發(fā)展起來的分子標志物檢測法，方法層出不窮，但如何選擇合適的篩查方法是醫(yī)生一直探討的問題。單一某種篩查方法都不能達到高臨床特異性、高陽性預測值、高敏感性，這就要求我們選擇多種篩查方式聯(lián)合檢測，才能達到不漏診、精準篩查。最后就是對篩出的高級別子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變盡早給予干預治療。這樣戰(zhàn)勝子宮頸癌指日可待。