小檗堿調(diào)節(jié)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增殖能力的機(jī)制研究

陳 靜，李 威，匡洪影，樊銳鋒，孫 河

0 引言

翼狀胬肉中醫(yī)稱“胬肉攀睛”，表現(xiàn)為結(jié)膜下良性纖維結(jié)締組織增生，可覆蓋至瞳孔區(qū)而嚴(yán)重影響視力，是戶外工作人群易發(fā)的、對(duì)患者生存質(zhì)量影響嚴(yán)重的眼表疾病[1]。翼狀胬肉的發(fā)生與環(huán)境中的微塵顆粒(PM2.5等)刺激有關(guān)，隨著環(huán)境污染和PM2.5對(duì)人類活動(dòng)影響的加劇，對(duì)此類眼表疾病的發(fā)生亦起到推動(dòng)作用[2]。目前翼狀胬肉治療方式以手術(shù)治療為主，但術(shù)后的復(fù)發(fā)率高達(dá)20%～70%[3]，且缺乏有效藥物控制胬肉的術(shù)后復(fù)發(fā)。依據(jù)胬肉攀睛“心肺風(fēng)熱、脾胃實(shí)熱、虛火上炎”的發(fā)病機(jī)制，具有“清熱燥濕、瀉火解毒”作用的黃連在中醫(yī)治療胬肉攀睛的經(jīng)典方劑中廣泛應(yīng)用[4-6]。而對(duì)黃連主要成分小檗堿的藥理機(jī)制研究表明，小檗堿在多種類型細(xì)胞中都能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-8]。翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的異常增生是造成胬肉組織形成和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵，如果小檗堿能控制胬肉細(xì)胞的增殖或凋亡，將對(duì)翼狀胬肉的預(yù)后起到有益的作用。故本研究使用小檗堿對(duì)體外培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察小檗堿對(duì)人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞凋亡的影響和凋亡相關(guān)因子的表達(dá)變化。

表1 引物序列

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1取材翼狀胬肉組織由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科翼狀胬肉患者手術(shù)切取獲得。研究方案經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審查備案(文件號(hào)：HZYLLBA201901)。獲取樣本前，已經(jīng)充分與患者進(jìn)行知情同意溝通。

1.1.2藥物和試劑實(shí)驗(yàn)用小檗堿(上海源葉生物科技有限公司，CAT：B21379)、分散酶(Sigma，CAT：D4693)、胰酶(Gibco，CAT：2520056)、小鼠抗人波形蛋白抗體(Proteintech，CAT：60330-1-Ig)、兔抗角蛋白抗體(Proteintech，CAT：26411-1-AP)、CCK8試劑盒(Solarbio，CAT：CA1210)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)，CAT：C1062M)、SYBR Green染料試劑盒(Roche，CAT：04913914001)、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)，CAT：C2006)。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器Allegra X-30超速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman)、M7000熒光顯微鏡(美國(guó)EVOS)、LC480實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Roch)、ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek)。

1.2方法

1.2.1翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

1.2.1.1翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)臨床手術(shù)切除的翼狀胬肉組織保存于生理鹽水中，1h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。胬肉組織經(jīng)pH=7.4的PBS沖洗3次后用PBS配制的終濃度50μmol/L分散酶37℃孵育1h。隨后剪碎胬肉組織，同時(shí)加入2.5g/L胰酶37℃消化5min，使用移液器吹散組織塊充分釋放單細(xì)胞。使用孔徑為40μm的細(xì)胞篩網(wǎng)對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行過(guò)濾，將分離后的細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液37℃，5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，2～3d更換培養(yǎng)液1次，穩(wěn)定傳代3～5次后用于后續(xù)研究。

1.2.1.2人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的鑒定穩(wěn)定生長(zhǎng)的翼狀胬肉細(xì)胞經(jīng)2.5g/L胰酶消化后接種于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿板底70%左右面積時(shí)，移除培養(yǎng)液并使用4%多聚甲醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。固定后的細(xì)胞經(jīng)0.5% Triton X-100室溫透膜30min和5% BSA室溫封閉1h后加入用5% BSA稀釋的含有1%小鼠抗人波形蛋白單抗和1%兔源角蛋白多抗的一抗混合物，4℃過(guò)夜孵育。孵育結(jié)束后PBS清洗3次，加入5% BSA稀釋的含1% FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗及1% TRITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗混合物，室溫孵育30min后，經(jīng)PBS洗滌和DAPI復(fù)染后，使用熒光顯微鏡，觀察發(fā)射波長(zhǎng)530nm波形蛋白表達(dá)情況和發(fā)射波長(zhǎng)630nm角蛋白表達(dá)情況。同時(shí)以人宮頸癌上皮細(xì)胞(Hela細(xì)胞)作為熒光染色的陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.2小檗堿藥物作用濃度的確定實(shí)驗(yàn)用小檗堿使用DMSO配制成濃儲(chǔ)液。正式實(shí)驗(yàn)前，使用96孔板培養(yǎng)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞，將初始細(xì)胞濃度調(diào)整為1×103cells/mL，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，按照濃度梯度分別向培養(yǎng)液中加入終濃度為10、20、40、80、160μmol/L的小檗堿，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。待培養(yǎng)24h后，移除培養(yǎng)液并使用PBS清洗細(xì)胞3次后，每個(gè)培養(yǎng)孔中加入100μL CCK8反應(yīng)液，5% CO2孵箱37℃條件孵育1h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處吸光度值(OD值)。使用GraphPad Prism 7.0軟件對(duì)所獲得的小檗堿濃度梯度處理后各組細(xì)胞的光吸收值進(jìn)行非線性分析，得到小檗堿培養(yǎng)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞24h的IC50值為83.22μmol/L，在后續(xù)研究中我們以IC50值為參考進(jìn)行小檗堿藥物濃度的設(shè)定。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組和藥物處理我們將體外培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞隨機(jī)分為4組，對(duì)照組為不加小檗堿的正常細(xì)胞，以小檗堿IC50濃度為最高濃度處理組(80μmol/L)，并按照濃度梯度50%遞減的原則設(shè)立中間濃度40μmol/L和低濃度20μmol/L處理組。所有細(xì)胞中均加入等量的用于溶解小檗堿的DMSO，各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.4各組翼狀胬肉成纖維細(xì)胞凋亡比率檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒按照試劑盒推薦步驟，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率。

1.2.5各組翼狀胬肉成纖維細(xì)胞實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞在培養(yǎng)結(jié)束后使用Trizol法抽提細(xì)胞內(nèi)總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，使用SYBR Green染料法和LC480實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，采用2-△△CT法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平，所檢測(cè)指標(biāo)的具體引物序列見(jiàn)表1。

圖1 體外培養(yǎng)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的鑒定(×100)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞凋亡水平 A：對(duì)照組；B：20μmol/L小檗堿組；C：40μmol/L小檗堿組；D：80μmol/L小檗堿組。

1.2.6各組翼狀胬肉成纖維細(xì)胞Western blot檢測(cè)各組翼狀胬肉細(xì)胞使用RIPA裂解液冰浴狀態(tài)下裂解，按每組每個(gè)指標(biāo)50μg總蛋白的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)8% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白后，采用半干轉(zhuǎn)印的方式(20V，40min)將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，PVDF膜經(jīng)TBST漂洗3次后，5%脫脂牛奶封閉，分別應(yīng)用封閉液配制的兔源多克隆抗Bcl-2抗體(Abcam，CAT：ab196495，1∶2000)、兔源多克隆抗Bad抗體(Abcam，CAT：ab90435，1∶2000)、兔源單克隆抗Bax抗體(Abcam，CAT：ab182733，1∶2000)及小鼠源單克隆抗β-actin抗體(Santa Cruz，CAT：sc-70319，1∶2000)4℃孵育過(guò)夜。過(guò)夜孵育后，使用TBST漂洗PVDF膜3次，每次5min。隨后除β-actin加入山羊抗小鼠HRP標(biāo)記的IgG二抗(中杉金橋，CAT：ZB-2305，1∶5000)，其余因子均加入山羊抗兔HRP標(biāo)記的IgG二抗(中杉金橋，CAT：ZB-2301,1∶5000)室溫孵育1h后，加入ECL發(fā)光液，使用GelDoc EZ凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BioRad)進(jìn)行放射自顯影檢測(cè)，所獲得的圖像經(jīng)軟件分析密度與面積，目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=(目標(biāo)基因密度×面積)/(同組β-actin密度×面積)。

1.2.7各組翼狀胬肉成纖維細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)(JC-1染色)線粒體膜電位染色使用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒按照推薦步驟進(jìn)行操作，并使用熒光顯微鏡對(duì)JC-1染色后細(xì)胞530nm綠色熒光和590nm紅色熒光信號(hào)進(jìn)行拍照鏡檢；同時(shí)使用流式細(xì)胞儀以530nm熒光為橫軸，590nm熒光為縱軸對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。圈選對(duì)照組細(xì)胞分布集中區(qū)域設(shè)定為未發(fā)生去極化的正常細(xì)胞，并同一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)不同濃度小檗堿處理后的細(xì)胞進(jìn)行圈選，比較圈選范圍內(nèi)未發(fā)生去極化細(xì)胞比率的差異。

2 結(jié)果

2.1體外培養(yǎng)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞鑒定Hela細(xì)胞、體外培養(yǎng)翼狀胬肉細(xì)胞的波形蛋白和角蛋白染色結(jié)果見(jiàn)圖1。體外培養(yǎng)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞波形蛋白染色陽(yáng)性，角蛋白染色陰性，符合成纖維細(xì)胞的蛋白表達(dá)特征。Hela細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，其角蛋白和波細(xì)胞形蛋白都呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明熒光雙染的鑒定方案可行。熒光染色結(jié)果證明，所培養(yǎng)的細(xì)胞確定為成纖維細(xì)胞，且純度較高，可用于后續(xù)研究。

2.2細(xì)胞凋亡比率檢測(cè)結(jié)果各組細(xì)胞采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑染色并經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后的結(jié)果見(jiàn)圖2，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后Q1象限為死亡細(xì)胞，Q2象限為晚期凋亡細(xì)胞，Q3象限為正常細(xì)胞，Q4象限為早期凋亡細(xì)胞。從結(jié)果可以看出，不同濃度小檗堿處理24h后，四組間凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=382.75，P<0.001)，隨著小檗堿濃度的提高，Q2和Q4象限細(xì)胞比率逐漸增加，說(shuō)明小檗堿以劑量依賴的方式促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。以Q2和Q4象限細(xì)胞所占比例之和代表細(xì)胞凋亡的總比例，與未加小檗堿的對(duì)照組相比，終濃度20、40和80μmol/L小檗堿處理后細(xì)胞凋亡比率均顯著升高(P<0.05)，并且隨著小檗堿濃度的提高，其凋亡比率呈現(xiàn)明顯的劑量依賴趨勢(shì)(表2)。

2.3凋亡相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果四組間抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=717.71，P<0.001)；與未加入小檗堿的對(duì)照組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)水平隨著小檗堿終濃度的提高而顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與之相對(duì)應(yīng)的是Bax和Bad這兩個(gè)促凋亡基因的蛋白表達(dá)水平，四組間Bax和Bad蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=243.24、297.51，P<0.001)，且隨著小檗堿濃度的提高而明顯增加。對(duì)蛋白表達(dá)強(qiáng)度的灰度分析表明，與對(duì)照組相比促凋亡因子Bax和Bad蛋白表達(dá)水平隨著小檗堿終濃度的提高而逐漸增高，在40、80μmol/L小檗堿處理后翼狀胬肉成纖維細(xì)胞中Bax和Bad蛋白表達(dá)水平與不加小檗堿的對(duì)照組相比均顯著升高(Bax：20μmol/L，P=0.180；40μmol/L，P<0.001；80μmol/L，P<0.001。Bad：20μmol/L，P=0.218；40μmol/L，P<0.001；80μmol/L，P<0.001，圖3，表2)。

表2 不同濃度小檗堿處理24h對(duì)細(xì)胞凋亡和凋亡蛋白表達(dá)的影響

注：aP<0.05，bP<0.01vs對(duì)照組。

表3 不同濃度小檗堿處理24h后未發(fā)生線粒體去極化細(xì)胞比率和凋亡基因mRNA的表達(dá)

注：aP<0.05，bP<0.01vs對(duì)照組。

凋亡相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果與蛋白表達(dá)水平的趨勢(shì)類似，四組間Bcl-2、Bcl-xl、Bad和Bax mRNA的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=165.10、154.99、851.71、22.48，P<0.001，表3)。隨著小檗堿終濃度的提高，抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)，尤其是40、80μmol/L小檗堿組中Bcl-2和Bcl-xl mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比均顯著降低(Bcl-2：20μmol/L，P=0.003；40μmol/L，P<0.001；80μmol/L，P<0.001。Bcl-xl：20μmol/L，P=0.338；40μmol/L，P<0.001；80μmol/L，P<0.001)，而促凋亡因子Bax和Bad mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比則呈顯著逐漸升高的趨勢(shì)(Bax：20μmol/L，P=0.115；40μmol/L，P<0.001；80μmol/L，P<0.001。Bad：20μmol/L，P=0.017；40μmol/L，P<0.001；80μmol/L，P<0.001)。

2.4細(xì)胞線粒體JC-1染色結(jié)果在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物產(chǎn)生590nm紅色熒光；而在去極化狀態(tài)下即線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，可以產(chǎn)生530nm的綠色熒光。結(jié)果表明，隨著小檗堿濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度逐漸增加，說(shuō)明細(xì)胞線粒體去極化水平逐漸提高(圖4A)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果也表明，隨著小檗堿濃度的提高，流式細(xì)胞檢測(cè)圈選范圍內(nèi)即P1區(qū)細(xì)胞總體數(shù)量顯著降低(圖4B)。對(duì)未發(fā)生線粒體去極化的翼狀胬肉細(xì)胞所占比率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果也表明，四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=130.81，P<0.001，表3)。與對(duì)照組相比，隨著小檗堿終濃度的提高，未發(fā)生線粒體去極化的正常細(xì)胞比率顯著降低(20μmol/L：P=0.413；40μmol/L：P=0.001；80μmol/L：P<0.001)，說(shuō)明小檗堿以劑量依賴的方式對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞線粒體膜電位產(chǎn)生影響。

圖3 Western blot 檢測(cè)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞中凋亡蛋白Bcl-2、Bad、Bax 表達(dá)水平。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制與五臟密切相關(guān)，心通過(guò)手少陰心經(jīng)直接與目相連，心經(jīng)邪熱可直接上擾于目；眼球暴露于外，外感風(fēng)熱之邪客于心肺兩經(jīng)，心肺風(fēng)熱壅盛，經(jīng)絡(luò)瘀滯，則胬肉脹起；眾人多飲食不節(jié)損傷脾胃，內(nèi)生濕熱壅滯眼絡(luò)；過(guò)度勞欲，心陰暗耗，虛火上炎于目所致。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為翼狀胬肉是細(xì)胞凋亡與增生失衡導(dǎo)致的增生性眼表疾病，具體發(fā)病機(jī)制雖較為復(fù)雜，但目前公認(rèn)的是翼狀胬肉成纖維細(xì)胞異常增生是導(dǎo)致疾病發(fā)生的主要原因[9]，而翼狀胬肉成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞存在類似的生物學(xué)行為[10]。對(duì)翼狀胬肉組織中凋亡相關(guān)因子的研究發(fā)現(xiàn)，抗凋亡基因Bcl-2在翼狀胬肉中表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常結(jié)膜組織，且在復(fù)發(fā)性胬肉中Bcl-2基因的表達(dá)水平高于初發(fā)胬肉[11-12]。這說(shuō)明在翼狀胬肉成纖維細(xì)胞中凋亡基因的表達(dá)水平處于異常的狀態(tài)，通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平可能對(duì)翼狀胬肉細(xì)胞的異常增殖起到控制作用。

圖4 不同終濃度小檗堿作用24h后細(xì)胞線粒體去極化情況 A：翼狀胬肉成纖維細(xì)胞JC-1染色結(jié)果(×100)；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體去極化結(jié)果。

對(duì)小檗堿抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的研究結(jié)果表明，在結(jié)腸癌和胸腺癌細(xì)胞中小檗堿能夠通過(guò)降低Bcl-2的表達(dá)水平，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[13-14]。而我們對(duì)體外培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞中凋亡基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平的檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠下調(diào)體外培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞中Bcl-2和上調(diào)Bax、Bad mRNA的表達(dá)水平，而且對(duì)這些凋亡相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)水平的調(diào)節(jié)都呈現(xiàn)出明顯的劑量性。細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)與Bcl家族抗凋亡基因與促凋亡基因的表達(dá)比率有關(guān)[15]，抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)量降低和促凋亡因子Bax、Bad表達(dá)量的提高將可能造成細(xì)胞凋亡比率的提升，這一結(jié)果也與流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡比率的檢測(cè)結(jié)果相一致。Bcl家族分子則主要分布在線粒體內(nèi)膜，對(duì)線粒體功能的變化較為敏感[16]。我們前期在人卵巢顆粒細(xì)胞(KGN細(xì)胞)的研究結(jié)果表明，小檗堿能夠通過(guò)劑量依賴的方式促進(jìn)線粒體SIRT3因子的泛素化，從而可能對(duì)線粒體機(jī)能產(chǎn)生影響[17]。相關(guān)研究表明，小檗堿能夠在體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞線粒體局部聚集[18]，而在體外培養(yǎng)的B細(xì)胞中小檗堿能夠以劑量依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19]。在本研究中，小檗堿以劑量依賴的方式提高了翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的線粒體去極化水平及細(xì)胞凋亡比率，我們推測(cè)小檗堿抑制翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增殖的藥理機(jī)制很可能與其對(duì)線粒體功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。

線粒體是重要的能量代謝細(xì)胞器，線粒體功能的穩(wěn)定與細(xì)胞的存活密切相關(guān)。由于線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子不均勻分布產(chǎn)生質(zhì)子梯度，形成線粒體膜內(nèi)負(fù)外正的電壓差，線粒體膜電位是保持線粒體功能正常所必需的[20]。而當(dāng)線粒體受到不良因素影響或衰老時(shí)線粒體內(nèi)膜的電壓差減小或消失即發(fā)生去極化現(xiàn)象，去極化現(xiàn)象預(yù)示著線粒體功能的弱化及細(xì)胞能量代謝水平的下降，同時(shí)線粒體去極化比率的提高也是細(xì)胞凋亡的早期標(biāo)志性事件之一[21]。本研究結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)系統(tǒng)中小檗堿濃度的提高，JC-1單體綠色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明小檗堿顯著降低了線粒體的膜電位。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果也表明，隨著小檗堿濃度的提高，未發(fā)生線粒體去極化的細(xì)胞比例也逐漸降低。這些結(jié)果表明，小檗堿可能通過(guò)影響線粒體膜電位從而啟動(dòng)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的凋亡機(jī)制。

綜合以上結(jié)果表明，黃連的主要成分小檗堿能夠顯著提高翼狀胬肉細(xì)胞線粒體去極化水平、細(xì)胞凋亡比率和凋亡相關(guān)因子的表達(dá)水平。黃連味苦、性寒，入心、脾、胃、肝、大腸經(jīng)，直瀉心肺兩經(jīng)風(fēng)熱，燥脾胃濕熱，清心瀉火解毒，針對(duì)胬肉攀睛“心肺風(fēng)熱，虛火上炎”之病因病機(jī)而治本。小檗堿對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞線粒體機(jī)能的調(diào)節(jié)可能在一定程度上解釋了這一中醫(yī)理論的生物學(xué)機(jī)制。同時(shí)凋亡相關(guān)因子的表達(dá)及線粒體去極化水平的檢測(cè)也顯示，線粒體很可能是小檗堿的細(xì)胞內(nèi)作用靶點(diǎn)，通過(guò)激活線粒體途徑從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。有研究顯示，小檗堿能夠抑制線粒體復(fù)合體的生物學(xué)活性，從而對(duì)線粒體功能產(chǎn)生影響，這也從另一個(gè)方面印證了線粒體可能是小檗堿的藥效靶點(diǎn)[22]。雖然本研究發(fā)現(xiàn)小檗堿促進(jìn)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的凋亡，但目前有關(guān)小檗堿對(duì)不同細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用的研究結(jié)果并不一致，也有研究表明小檗堿也對(duì)線粒體凋亡途徑起到抑制作用[23-24]。我們推測(cè)造成小檗堿對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用的差異可能與小檗堿作用濃度和所研究的細(xì)胞類型有關(guān)。而我們?cè)谝頎铈廊獬衫w維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的小檗堿促進(jìn)胬肉細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果，為進(jìn)一步明確中藥療效的藥理機(jī)制及推動(dòng)中藥在眼表疾病治療方面的應(yīng)用提供了有力的數(shù)據(jù)支持。