廣州市某A2/O工藝城鎮(zhèn)污水處理廠出水對(duì)大型溞的生殖毒性作用

劉蕓，胡小英，趙旭，易皓，溫勇，胡國(guó)成，王煒

生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣州 510655

城市污水處理廠廢水中存在雙酚A、烷基酚類、鄰苯二甲酸酯類、有機(jī)磷農(nóng)藥、有機(jī)氯農(nóng)藥以及雌激素類污染物[1-4]，這些物質(zhì)已報(bào)道具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，對(duì)水生生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)造成影響，其中有些物質(zhì)還能夠通過(guò)改變雌雄激素水平而影響生物的繁殖能力。已有研究表明，城市污水與工業(yè)廢水已經(jīng)成為環(huán)境水體中內(nèi)分泌干擾物(EDC)的主要來(lái)源[5-7]。我國(guó)現(xiàn)行城市污水處理廠多采用A2/O處理工藝，對(duì)化學(xué)需氧量(COD)及氨氮具有較好的去除效果，但未對(duì)其中可能存在的毒害物質(zhì)進(jìn)行針對(duì)性的去除。

為了解污水處理廠廢水的生物毒性風(fēng)險(xiǎn)，馬梅等[8]利用T3發(fā)光菌檢測(cè)了某城市污水處理廠各處理段水樣的急性毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)進(jìn)入一級(jí)處理前水樣與處理結(jié)束后水樣均表現(xiàn)出發(fā)光抑制毒性；黃滿紅等[9]利用大型溞評(píng)價(jià)了上海市3家污水處理廠污水的急性毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)進(jìn)水具有一定的急性毒性，出水毒性降低；徐曉平等[10]發(fā)現(xiàn)，污水處理廠不同處理單元對(duì)污水毒性減弱能力存在差異，各處理工藝出水對(duì)大型溞仍然存在一定毒性，并且還認(rèn)為有必要開展污水生物毒性測(cè)試來(lái)作為判斷廢水水質(zhì)和污水處理工藝效果的一個(gè)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法。曹楠等[11]以生物遺傳毒性(UMU)和視黃酸受體(RAR)結(jié)合活性為指標(biāo)，調(diào)查了城市污水的生物毒性，發(fā)現(xiàn)污水廠出水仍然普遍具有遺傳毒性，部分污水廠出水仍殘留RAR結(jié)合活性。隨著尾水排放，尾水中殘留的污染物可能對(duì)水生生物造成危害，因此，研究污水處理廠廢水的毒性風(fēng)險(xiǎn)具有重大意義。

大型溞(Daphniamagna)是一種對(duì)水質(zhì)比較敏感的浮游動(dòng)物，廣泛分布于淡水水域，它以浮游植物為食，又是魚類和大型無(wú)脊椎動(dòng)物的餌料，是水生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的重要環(huán)節(jié)。同時(shí)，大型溞具有諸多優(yōu)點(diǎn)，包括生活周期短，生長(zhǎng)快，生殖量高，易培養(yǎng)，對(duì)水環(huán)境脅迫敏感等，故其被廣泛應(yīng)用于各種毒性測(cè)試，已被證明能對(duì)重金屬[12-15]、藻毒素[16-17]和殺蟲劑[18-19]等多種毒性物質(zhì)進(jìn)行毒性表征。急性毒性實(shí)驗(yàn)以死亡為終點(diǎn)主要檢測(cè)污染物的致死效應(yīng)，而慢性毒性實(shí)驗(yàn)可以更深入地了解有毒物質(zhì)對(duì)生物的長(zhǎng)期慢性影響，其中Dao等[16]利用Daphniamagna慢性毒性方法檢測(cè)了藍(lán)藻毒素的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)除了致死效應(yīng)，低濃度下藍(lán)藻毒素能對(duì)大型溞的生長(zhǎng)與生殖產(chǎn)生影響；李爽和徐鏡波[20]的研究表明，大型溞第一次產(chǎn)溞時(shí)間和產(chǎn)溞總量是表征生殖毒性最靈敏的生理參數(shù)。大型溞慢性毒性測(cè)試已被證明適用于地表水體的毒性評(píng)價(jià)[21]。美國(guó)環(huán)保局已將大型溞用于短期慢性毒性評(píng)價(jià)，并證實(shí)這是一種有效的評(píng)價(jià)方法[22]。

綜上，城鎮(zhèn)污水處理廠廢水毒性研究主要集中在急性毒性測(cè)試，慢性毒性測(cè)試的相關(guān)研究尚鮮見報(bào)道。利用大型溞開展城鎮(zhèn)污水處理廠不同污水處理單元出水毒性檢驗(yàn)的研究有限[23]，本研究應(yīng)用大型溞14 d慢性毒性測(cè)試方法對(duì)廣州地區(qū)某污水處理廠各工藝段出水進(jìn)行毒性效應(yīng)測(cè)試，了解城鎮(zhèn)污水處理廠污水毒性的變化規(guī)律，從綜合生物毒性角度評(píng)價(jià)現(xiàn)行污水處理廠A2/O工藝的脫毒減害效果。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)水樣

樣品采集瓶采用棕色帶塞細(xì)口玻璃瓶，樣品瓶經(jīng)重鉻酸鉀洗液潤(rùn)洗浸泡過(guò)夜，用自來(lái)水、蒸餾水洗凈后倒置晾干待用。采集的樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后立即于4 ℃下保存，不添加任何溶劑及藥品，直接取出適量進(jìn)行檢測(cè)。

樣品采集于廣州地區(qū)某污水處理廠，該污水處理廠采用A2/O工藝，于2012年12月一次性采集各工藝段出水(圖1)。

圖1 污水處理廠各工藝廢水樣品采樣點(diǎn)示意圖Fig. 1 Flow chart of wastewater sampling sites in sewage treatment plant

采集水樣水質(zhì)常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表1所示，由表1可知，本次實(shí)驗(yàn)所采集水樣在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)數(shù)值未發(fā)生顯著變化，說(shuō)明在試驗(yàn)周期內(nèi)水樣性狀較為穩(wěn)定。

1.2 受試生物與培養(yǎng)條件

大型溞(Daphniamagna)是一種濾食動(dòng)物，以綠藻、細(xì)菌或酵母為食，成熟母溞體長(zhǎng)3～5 mm，通體透明，可以通過(guò)體式顯微鏡直接觀察包括心跳和腸道等內(nèi)部器官的情況。大型溞能分別進(jìn)行孤雌生殖(外界環(huán)境適宜時(shí))和有性生殖(外界環(huán)境惡化時(shí))，并且產(chǎn)溞量高，所以大型溞適合作為生殖毒性研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。本研究所用大型溞來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，已在本實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定培養(yǎng)3代以上，在溫度(22±2) ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照周期16 h L∶8 h D，大型溞的餌料為3N-BBM培養(yǎng)基培養(yǎng)的小球藻藻液。

表1 水樣常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)Table 1 Conventional water qualities of water sample

1.3 測(cè)試方法

本研究稀釋水采用ISO-6341(1996)推薦的人工重組水作為稀釋水和空白對(duì)照，具體組分如下：KCl 5.8 mg L-1，NaHCO364.8 mg L-1，MgSO4·7H2O 123 mg L-1，CaCl2·2H2O 294 mg L-1，pH 7.8±0.2。實(shí)驗(yàn)選用同一母體后代、出生6～24 h、個(gè)體均勻的幼體為試驗(yàn)用溞。懷卵母溞在產(chǎn)幼前轉(zhuǎn)移到不加食物的水體中，從而保證受試溞未進(jìn)食。

1.3.1 48 h急性毒性測(cè)試

本研究急性毒性測(cè)試參考《水質(zhì)物質(zhì)對(duì)溞類(大型溞)急性毒性測(cè)定方法GB/T 13266—91》，實(shí)驗(yàn)期間不喂食并及時(shí)移除死亡溞，每24 h更換80%試驗(yàn)液。

具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程：試驗(yàn)在100 mL結(jié)晶皿中進(jìn)行，每個(gè)結(jié)晶皿加入50 mL水樣與1只幼溞，每個(gè)水樣的3個(gè)濃度組分別設(shè)置4個(gè)平行，每個(gè)平行3個(gè)重復(fù)，空白對(duì)照使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水，及時(shí)觀察并記錄大型溞運(yùn)動(dòng)與死亡情況，試驗(yàn)期間不喂食，試驗(yàn)溫度為(24±1) ℃。測(cè)試樣品濃度分別為：不稀釋時(shí)濃度(用100%表示)、稀釋2倍時(shí)濃度(用50%表示)和稀釋10倍時(shí)濃度(用10%表示)。

1.3.2 14 d慢性毒性測(cè)試

大型溞14 d慢性毒性實(shí)驗(yàn)采用半靜態(tài)實(shí)驗(yàn)，每隔24 h更換試驗(yàn)溶液的80%并喂食相同濃度小球藻藻液。實(shí)驗(yàn)在100 mL結(jié)晶皿中進(jìn)行，每個(gè)結(jié)晶皿中加入50 mL水樣與1只幼溞。設(shè)置100%原樣品，半倍稀釋(50%)樣品和四倍稀釋(25%)樣品3個(gè)濃度組，標(biāo)準(zhǔn)稀釋水作為對(duì)照組，每組設(shè)置4個(gè)平行，每個(gè)平行3個(gè)重復(fù)。記錄大型溞的第一胎產(chǎn)溞時(shí)間、第一胎產(chǎn)溞數(shù)量、試驗(yàn)期間產(chǎn)溞總數(shù)及母溞死亡數(shù)。試驗(yàn)周期為14 d。

1.4 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制

大型溞毒性測(cè)試中，對(duì)照組未出現(xiàn)不活動(dòng)大型溞，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)水樣中溶解氧濃度必須大于或等于2 mg L-1，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程溫度波動(dòng)范圍不超過(guò)1 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS V17.0軟件進(jìn)行樣本檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，用單因素方差分析(ANOVA)法分析各試驗(yàn)組與對(duì)照組大型溞第一胎產(chǎn)溞時(shí)間、第一胎產(chǎn)溞數(shù)量和試驗(yàn)周期內(nèi)母溞的總產(chǎn)溞數(shù)量之間的均值差異，所有圖片利用Excel繪制，P<0.05代表顯著性差異，用*表示。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 48 h急性毒性測(cè)試

48 h急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，由表2可知，8個(gè)水樣的各個(gè)稀釋濃度樣品，均未在48 h內(nèi)對(duì)大型溞活動(dòng)產(chǎn)生顯著抑制作用，對(duì)大型溞急性毒性作用很弱。根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研，該污水處理廠廢水來(lái)源主要為生活污水與少量印染廠廢水。已有研究顯示，生活污水與印染廢水對(duì)大型溞均為無(wú)顯著急性毒性效應(yīng)或僅有弱急性毒性效應(yīng)[8,24-25]，這與本研究結(jié)果基本一致。

2.2 第一胎產(chǎn)溞時(shí)間

試驗(yàn)大型溞第一胎產(chǎn)溞時(shí)間如圖2所示，在空白對(duì)照組中，12只大型溞的第一胎平均產(chǎn)溞時(shí)間9.67 d，與實(shí)驗(yàn)室日常養(yǎng)殖產(chǎn)溞時(shí)間以及文獻(xiàn)報(bào)道中正常產(chǎn)溞時(shí)間基本一致[24]，說(shuō)明在本研究采用的實(shí)驗(yàn)條件下，暴露組與對(duì)照組的差異是暴露樣品的作用導(dǎo)致的。

表2 48 h急性毒性測(cè)試結(jié)果Table 2 Results of 48 h acute toxicity

圖2 第一胎產(chǎn)溞時(shí)間注：*表示暴露組與空白組相比具有顯著差異性，P<0.05；下同。Fig. 2 Mean time to the production of the first broodNote: *indicates a significant difference between treatment and blank group, P<0.05; the same below.

將暴露組與對(duì)照組的第一胎產(chǎn)溞時(shí)間進(jìn)行組間差異分析，結(jié)果顯示，從1#到5#樣品所有濃度組均與對(duì)照組出現(xiàn)顯著性差異，6#和8#樣品100%濃度組與對(duì)照組比較有顯著的組間差異，另外，7#樣品50%稀釋濃度組與對(duì)照組的產(chǎn)溞時(shí)間存在顯著差異(圖2)。

廢水經(jīng)過(guò)細(xì)格柵和沉砂池處理后，僅僅除去了其中體積較大的雜物，而污水中具有毒性的化學(xué)物質(zhì)并未得到處理，所以，1#和2#樣品暴露對(duì)大型溞存在顯著的毒性作用。根據(jù)工藝圖(圖1)顯示，3#樣品為污泥回流后第一個(gè)水樣，而市政污水處理設(shè)施中的污泥中含有如壬基酚等污染物能讓溞類首次產(chǎn)溞時(shí)間延后[26]，回流污泥中的毒性物質(zhì)可能溶入水體，導(dǎo)致3#樣品暴露組與對(duì)照組產(chǎn)生顯著差異；經(jīng)過(guò)厭氧池處理，4#樣品中仍存在對(duì)大型溞具有生殖毒性的物質(zhì)；5#樣品為缺氧池出水與好氧池廢水回流后的混合物，仍顯示出明顯的生殖毒性，說(shuō)明其中具有生殖毒性的物質(zhì)未完全去除；6#樣品的50%與25%濃度組第一胎平均產(chǎn)溞時(shí)間早于對(duì)照組，且根據(jù)實(shí)驗(yàn)記錄顯示(未在文中列出)，對(duì)照組中母溞最早在第9天開始產(chǎn)溞，廢水樣品中只有6#樣品的50%與25%濃度組有大型溞在第9天開始產(chǎn)溞，其余樣品均從暴露第10天才開始產(chǎn)溞，因此，廢水樣品總體呈現(xiàn)第一胎產(chǎn)溞時(shí)間推后的趨勢(shì)。這與張澤光等[24]報(bào)道的造紙廢水經(jīng)傳統(tǒng)工藝處理后各工藝段出水均能延長(zhǎng)大型溞第一胎產(chǎn)溞時(shí)間的結(jié)論基本一致。經(jīng)好氧池處理后的6#樣品生殖毒性顯著降低，說(shuō)明好氧池處理是主要去除生殖毒性物質(zhì)的處理工藝。7#樣品為6#樣品經(jīng)過(guò)了物理處理后樣品，二者未顯示明顯差異。最后經(jīng)過(guò)紫外消毒后，8#樣品暴露也導(dǎo)致大型溞平均產(chǎn)溞時(shí)間有所推遲，8#水樣生殖毒性再次升高，可能是紫外消毒工藝過(guò)程讓處理水中的某些成分再次發(fā)生了變化，并產(chǎn)生了毒性物質(zhì)所致。因此，從整個(gè)工藝過(guò)程分析可知，經(jīng)過(guò)好氧池處理的出水對(duì)大型溞的生殖毒性作用減弱。

2.3 第一胎產(chǎn)溞數(shù)量

對(duì)大型溞第一胎產(chǎn)溞量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖3所示。在100%原樣濃度組中，1#～5#暴露組大型溞第一胎產(chǎn)溞量與對(duì)照組相比均出現(xiàn)顯著提高，而7#暴露組第一胎產(chǎn)溞量顯著低于對(duì)照組；50%濃度樣品組中，1#、2#和6#暴露組第一胎產(chǎn)溞量仍顯著高于對(duì)照，但與100%濃度組相比產(chǎn)溞量有所降低；而7#樣品第一胎產(chǎn)溞量顯著低于對(duì)照。所有樣品25%稀釋濃度組與對(duì)照組相比，均無(wú)顯著性差異(圖3)。

圖3 每只母溞第一胎產(chǎn)溞數(shù)量Fig. 3 The number of first brood per tested Daphnia magna

圖4 每只母溞暴露期產(chǎn)溞總數(shù)Fig. 4 Total fecundity per female Daphnia magna during exposure period

水樣對(duì)大型溞第一胎產(chǎn)溞數(shù)量的影響主要表現(xiàn)為增加大型溞產(chǎn)溞量，并隨著水處理工藝的進(jìn)行差異縮小。因此，水樣中應(yīng)該可能存在能夠刺激大型溞產(chǎn)溞的物質(zhì)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，廢水中部分污染物質(zhì)如溴代阻燃劑得克隆[27]、除草劑芐嘧磺隆[28]長(zhǎng)期暴露能顯著增加大型溞產(chǎn)溞次數(shù)和產(chǎn)溞總數(shù)，由此判斷本研究水樣中可能也存在某些能夠促進(jìn)大型溞產(chǎn)溞的污染物，如具有雌激素效應(yīng)的某些污染物，也可能是由于污染物之間的聯(lián)合效應(yīng)引起的。

從整個(gè)廢水處理工藝可以看出，從進(jìn)水到缺氧池出水各階段廢水均能顯著提高第一胎產(chǎn)溞數(shù)量，經(jīng)好氧池處理后毒性顯著降低。

2.4 試驗(yàn)周期內(nèi)總產(chǎn)溞量

為檢驗(yàn)受試溞在第一次產(chǎn)溞情況受到影響后，對(duì)暴露水樣是否產(chǎn)生適應(yīng)性，從實(shí)驗(yàn)開始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束共計(jì)14 d的時(shí)間內(nèi)，每天記錄每只母溞的產(chǎn)溞量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束計(jì)算每個(gè)暴露濃度組產(chǎn)溞總數(shù)，與對(duì)照組數(shù)量相差20%以上認(rèn)為具有顯著性差異。如圖4所示，在100%原水樣品測(cè)試中，1#與2#樣品暴露組母溞產(chǎn)溞總量顯著高于對(duì)照組；6#和8#樣品暴露組母溞產(chǎn)溞總量顯著低于對(duì)照組；50%稀釋樣測(cè)試中，只有1#樣品暴露組母溞產(chǎn)溞總量仍明顯高于對(duì)照組，具有顯著性差異；5#與7#樣品暴露組母溞產(chǎn)溞總量明顯低于對(duì)照組，具有顯著性差異。25%稀釋濃度下，只有3#和7#樣品暴露組母溞產(chǎn)溞總量顯著低于對(duì)照組水平，其余樣品均未出現(xiàn)顯著性差異(圖4)。

經(jīng)過(guò)1#100%水樣、50%稀釋水樣及2#100%水樣暴露，大型溞產(chǎn)溞量顯著高于對(duì)照組，這與大型溞第一胎產(chǎn)溞數(shù)量整體呈上升趨勢(shì)一致，也可以說(shuō)明水樣中存在能夠刺激大型溞產(chǎn)溞的物質(zhì)。隨著處理工藝的進(jìn)行，后續(xù)水樣暴露后，陸續(xù)出現(xiàn)大型溞產(chǎn)溞量低于對(duì)照組的現(xiàn)象，這說(shuō)明能夠刺激產(chǎn)溞的污染物在后續(xù)的處理工藝中逐漸被去除，同時(shí)水體樣品中也可能存在能夠抑制其產(chǎn)溞的污染物，這部分污染物未被去除或是未完全被去除，在刺激大型溞產(chǎn)溞的物質(zhì)不存在后，這部分抑制性污染物起到主導(dǎo)作用，表現(xiàn)出引起大型溞產(chǎn)溞量減少的情況。

在2.3中已經(jīng)介紹過(guò)廢水中部分污染物能刺激大型溞產(chǎn)溞，致產(chǎn)溞數(shù)量上升。同時(shí)，亦有研究表明，廢水中也存在大量能抑制大型溞產(chǎn)溞的污染物，如孫凱峰[26]報(bào)道壬基酚能讓溞類每次繁殖總數(shù)降低；劉青等[29]表示印楝素能抑制大型溞的生殖頻率；熊勤犁等[30]報(bào)道2,2’,4,4’-四溴二苯醚(BDE47)能使大型溞總產(chǎn)溞數(shù)量大幅減少；邵蕾等[14]也發(fā)現(xiàn)重金屬鎘暴露能降低大型溞每胎產(chǎn)溞總數(shù)。

污水處理廠不同取樣點(diǎn)污水對(duì)大型溞不存在急性毒性效應(yīng)，大型溞第一胎產(chǎn)溞的時(shí)間、產(chǎn)溞量以及大型溞總產(chǎn)溞量能夠作為對(duì)污水處理廠各工藝階段廢水進(jìn)行生殖毒性評(píng)價(jià)的有效指標(biāo)；在采用A2/O工藝的污水處理廠中好氧池處理工藝對(duì)生殖毒性物質(zhì)去除效果最為顯著，但是污水處理廠出水潛在的生殖毒性仍然應(yīng)該引起關(guān)注。