人高致病性冠狀病毒感染的免疫病理損傷及其機制*

李紫薇，楊東亮，劉 嘉

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院感染性疾病科，武漢 430022

2019年12月下旬，湖北省武漢市衛(wèi)生機構(gòu)報告了多起不明原因肺炎的聚集性病例。2020年1月初，不明原因肺炎的病原體被確定為一種新的冠狀病毒，該致病病毒被暫命名為2019新型冠狀病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)[1]，后又于2020年2月11日被國際病毒分類委員會建議命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)。迄今為止，除中國外已有其他206個國家和地區(qū)相繼報告了SARS-CoV-2的確診病例，世衛(wèi)組織總干事于2020年1月30日宣布SARS-CoV-2的爆發(fā)構(gòu)成國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。根據(jù)世界衛(wèi)生組織每日疫情報告，截至北京時間2020年4月9日17時，在中國已有83249例SARS-CoV-2確診病例和3344例死亡病例，在其他206個國家和地區(qū)已有1352949例確診病例和82178例死亡病例。

冠狀病毒宿主廣泛，包括人和多種野生動物，可引起呼吸道、腸道、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)等多組織器官疾病。截止目前，SARS-CoV-2是可感染人類的第7種冠狀病毒，也是第3種已知的人高致病性冠狀病毒。另外2種高致病性冠狀病毒，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)也曾于近些年來出現(xiàn)爆發(fā)流行，并具有較高的死亡率[2-3]。SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2感染在臨床表現(xiàn)上有諸多相似之處，患者起病以呼吸道癥狀為主，部分重癥患者會進展為急性肺損傷及嚴重急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)及多器官功能衰竭等[4-5]。既往針對高致病性冠狀病毒感染發(fā)病機制的研究顯示，除病毒直接感染細胞誘導的細胞病變效應外，病毒感染引發(fā)的免疫病理損傷在疾病重癥化的過程中發(fā)揮了重要作用。本文對SARS-CoV、MERS-CoV及新發(fā)現(xiàn)的SARS-CoV-2感染過程中的免疫病理損傷及其機制加以總結(jié)與討論，以期為制訂有效的臨床治療策略提供理論依據(jù)。

1 SARS-CoV感染的免疫病理損傷及機制

通過對SARS-CoV感染死亡病例的解剖，可以觀察到肺部水腫及多處充血，肺門和腹腔淋巴結(jié)腫大，肺臟重量增加，脾臟體積及重量減少，肺組織學檢查顯示肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)有廣泛的中性粒細胞和巨噬細胞浸潤、支氣管上皮脫落、纖毛脫落和鱗狀上皮化生[6-8]。SARS-CoV感染早期的肺部組織病理學特征通常與急性彌漫性肺泡損傷有關(guān)，而后期表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷合并急性纖維素性機化性肺炎[9]。在循環(huán)淋巴細胞、單核細胞和淋巴組織中，以及呼吸道上皮細胞、腸黏膜、腎遠端小管上皮細胞、腦內(nèi)神經(jīng)元和駐留在不同器官中的組織內(nèi)巨噬細胞中均可檢測到大量的SARS-CoV顆粒和核酸[8]，這些細胞表面均表達SARS-CoV的受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme，ACE2)，病毒可通過ACE2進入上述細胞[10]。免疫熒光原位雜交和電鏡檢查均顯示SARS-CoV RNA和細胞角蛋白在肺內(nèi)共定位，提示了肺泡上皮細胞被SARS-CoV感染[11-12]。此外，肺泡巨噬細胞中偶見SARS-CoV[12]。

迄今為止，對SARS-CoV感染的發(fā)病機制所知仍非常有限。SARS-CoV感染患者的彌漫性肺損傷可能與以下因素相關(guān)：①高初始病毒滴度[13]；②肺內(nèi)單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞浸潤增加[6]；③血清促炎細胞因子和趨化因子水平升高[14]。因此，SARS-CoV感染的重癥化可能是由于病毒感染直接誘導的細胞病變效應和高細胞因子血癥或“細胞因子風暴(cytokine storm)”引起的免疫病理損傷共同作用的結(jié)果。對SARS-CoV感染期間細胞因子/趨化因子譜變化的研究表明，循環(huán)中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8和CXCL10等細胞因子/趨化因子水平的升高，可能是導致SARS-CoV感染患者預后不良的原因[15]。相較于非重癥SARS患者，重癥患者的血清促炎細胞因子如IL-1、IL-6、IL-12、IL-8、干擾素(interferon，IFN)-γ和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor，TGF-β)及趨化因子CCL2、CXCL9和CXCL10的水平明顯升高(P<0.01)[14，16-18]。此外，通過早期誘導CXCL10和IL-2，導致IL-6的產(chǎn)生過多和IL-10的產(chǎn)生不足被認為是造成SARS-CoV感染期間肺損傷的免疫病理過程[17]。干擾素γ誘導蛋白-10(interferon γ-induced protein 10，IP-10)和IL-2在趨化和活化單核/巨噬細胞方面發(fā)揮重要作用[19-21]，而后者是SARS患者肺部主要炎癥細胞類型[6]。在SARS-CoV感染急性期，可在患者血清中檢測到高水平的IP-10和IL-2[16-17，22]。因此，IP-10和IL-2可能通過活化單核/巨噬細胞介導SARS感染過程中肺部的免疫病理損傷。Gralinski等[23]的研究證實，補體系統(tǒng)是SARS-CoV誘導疾病的重要宿主介質(zhì)，補體系統(tǒng)激活可通過上調(diào)包括粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，GCSF)、IL-6、TNF-α等多種細胞因子和趨化因子的水平，介導SARS-CoV感染的炎癥進展。此外，IFN-α、IFN-γ和干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)的持續(xù)高表達與SARS病情早期惡化相關(guān)[24-25]。研究表明，SARS-CoV感染導致Ⅰ型IFN表達延遲[26]，I型IFN信號轉(zhuǎn)導延遲與病毒活躍復制共同促進了促炎細胞因子和炎癥單核/巨噬細胞(inflammatory monocyte-macrophages，IMMs)的聚集，導致肺內(nèi)細胞因子/趨化因子水平升高，血管滲漏和病毒特異性T細胞反應受損[27]。同時，Ⅰ型IFN可通過致敏T細胞使其凋亡，進而導致病毒特異性CD8+和CD4+T細胞數(shù)量減少[28]。CD4+T細胞消耗會引起肺內(nèi)淋巴細胞的募集減少及中和抗體和細胞因子減少，進而導致強烈的免疫反應介導的間質(zhì)性肺炎及肺內(nèi)病毒清除延遲[29]。

2 MERS-CoV感染的免疫病理損傷及機制

研究表明，MERS-CoV感染的病理特征包括滲出性彌漫性肺泡及肺透明膜損傷、肺水腫、Ⅱ型肺細胞增生、以淋巴細胞為主的間質(zhì)性肺炎和多核合胞細胞、支氣管黏膜下腺壞死等[30-31]。上述支氣管病變是MERS-CoV感染致呼吸衰竭的病理基礎(chǔ)[32]。MERS-CoV在肺部感染的靶細胞包括肺泡上皮細胞、呼吸道上皮細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和支氣管黏膜下腺細胞等[30]，這些細胞表面表達的多功能蛋白二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP4)是MERS-CoV進入細胞的主要受體[33]。電鏡下觀察可見，病毒顆粒存在于肺泡上皮細胞、肺巨噬細胞、浸潤骨骼肌的巨噬細胞和腎近曲小管上皮細胞中[31]。1例MERS-CoV感染患者的腎穿刺活檢顯示其出現(xiàn)了急性腎小管間質(zhì)腎炎、急性腎小管硬化及蛋白管型的形成，這與MERS-CoV的組織學定位一致[34]。

MERS-CoV的受體DPP4廣泛表達于腎、肺泡、小腸、肝臟、前列腺上皮細胞和活化的白細胞[35]，提示MERS-CoV擁有更廣的組織學分布范圍[36]。與SARS-CoV不同的是，MERS-CoV能夠感染許多人類免疫細胞，包括樹突狀細胞[37]、巨噬細胞[38]和T細胞[39]。MERS患者肺部病變的嚴重程度與肺部中性粒細胞和巨噬細胞的廣泛浸潤以及外周血中這些細胞的較高數(shù)量相關(guān)[30]。MERS-CoV感染的樹突狀細胞和巨噬細胞可持續(xù)產(chǎn)生多種促炎細胞因子和趨化因子，如TNF-α、IL-6、IL-8、CXCL10、CCL2、CCL3和CCL5[37-38]，但其產(chǎn)生時效有所延遲[38，40]。這些細胞因子的促炎和趨化作用被認為與免疫細胞浸潤下呼吸道及嚴重的炎癥和組織損傷有關(guān)。最近的研究表明，與輕中度MERS-CoV感染患者相比，重度MERS-CoV感染患者血清促炎細胞因子(如IL-6和IFN-α)和趨化因子(如IL-8、CXCL10和CCL5)水平升高[41-42]。與健康人相比，MERS-CoV感染患者血清IFN-α2、IFN-γ、TNF-α、IL-15、IL-17、IL-10表達明顯升高，表現(xiàn)為明顯的Th1型和Th17型炎癥反應[43]。

CD4+和CD8+T細胞在MERS-CoV感染過程中均發(fā)揮重要的抗病毒作用，然而CD4+T細胞對MERS-CoV感染更為敏感，這可能進一步導致B細胞功能受損[44-45]。被MERS-CoV感染的人CD4+和CD8+T細胞中，外源性和內(nèi)源性凋亡途徑均被激活[39，45]。MERS-CoV正是通過這種機制逃避外周血和淋巴器官中的T細胞應答，而這也可能是造成病毒傳播和嚴重免疫病理損傷的原因之一[39]。有研究表明，DPP4受體在T細胞信號轉(zhuǎn)導、活化和共刺激方面發(fā)揮重要作用，而MERS-CoV可通過下調(diào)DDP4進而損傷T細胞功能[46]。此外，據(jù)報道，MERS-CoV還可以通過上調(diào)Smad7和成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)的表達來誘導腎和肺泡上皮細胞凋亡[47]。

3 SARS-CoV-2感染的免疫病理損傷及機制

宏基因組測序結(jié)果表明，SARS-CoV-2屬于β冠狀病毒屬，與SARS-CoV及MERS-CoV分別有79.0%和51.8%的核苷酸同源性[48]。據(jù)報道，SARS-CoV-2基因組與蝙蝠冠狀病毒有96%同源性[49]。SARS-CoV-2被證實通過ACE2受體感染靶細胞[49]。體外實驗表明，將SARS-CoV-2接種到人氣道上皮細胞表面層會導致細胞病變和細胞纖毛跳動停止[4]。通過對SARS-CoV-2感染造成的聚集性疫情分析，本身患有基礎(chǔ)疾病等合并癥的老年男性更為易感，并可導致嚴重甚至致命的呼吸道疾病[50-52]。SARS-CoV-2感染首發(fā)臨床癥狀主要包括發(fā)燒、干咳、肌痛、疲勞和腹瀉等[53]。若患者病情進展，將出現(xiàn)大量肺泡損傷、進展性呼吸衰竭、淋巴細胞減少甚至死亡[5，50，53-54]。一項對658名SARS-CoV-2患者的回顧性研究顯示，大多數(shù)感染者均合并有器官功能損傷，其中35例(67%)合并ARDS，15例(29%)合并急性腎損傷，12例(23%)合并心臟損傷，15例(29%)合并肝功能障礙，1例(2%)合并氣胸[52]。通過對一例COVID-19死亡尸體的系統(tǒng)解剖，可觀察到死者肺部損傷明顯，存在炎性病變(灰白色病灶)，肺泡內(nèi)含大量黏稠分泌物，并可見纖維條索[55]。而對COVID-19遺體的穿刺組織病理學研究也觀察到類似的現(xiàn)象，即肺組織呈現(xiàn)肺泡內(nèi)滲出性炎、肉質(zhì)變、間質(zhì)炎和纖維化等多樣性病變，肺泡腔內(nèi)可見透明膜形成并存在單核/巨噬細胞浸潤，肺泡和肺間質(zhì)可見少量CD4+T細胞[56]，Tian等[57]的研究還發(fā)現(xiàn)了由于間質(zhì)成纖維細胞和Ⅱ型肺泡細胞增生導致的肺泡壁彌漫性增厚。通過對一例死于COVID-19患者的肺、肝及心臟的組織樣本的組織學檢查，可見雙肺彌漫性肺泡損傷和細胞纖維黏液樣滲出物，其中右肺可見明顯的肺泡上皮細胞脫屑和肺透明膜形成，提示ARDS；左肺顯示肺水腫伴透明膜形成，也提示早期ARDS[58]。雙肺間質(zhì)均可見以淋巴細胞為主的單個核細胞炎性浸潤。肺泡內(nèi)可見表現(xiàn)為病毒樣細胞病變的多核合胞細胞，但未發(fā)現(xiàn)明顯的核內(nèi)或胞質(zhì)內(nèi)病毒包涵體[58]，以上COVID-19的肺部病理特征與SARS-CoV或MERS-CoV感染非常相似，即病理學改變主要為靶向于雙肺的彌漫性肺泡損傷、水腫和肺透明膜形成，表現(xiàn)為以單核巨噬細胞和淋巴細胞滲出為主的炎性細胞浸潤和肺泡上皮細胞損傷[59]。此外，該患者的肝組織樣本顯示微血管中度脂肪變性和肝小葉及門脈輕度活動性炎癥，表明損傷可能是由SARS-CoV-2感染或藥物誘導的肝損傷造成的[58]。心臟組織除間質(zhì)中有少量單核炎癥細胞浸潤，無其他實質(zhì)性損害，提示SARS-CoV-2可能不直接損害心臟[58]。通過流式細胞術(shù)，可發(fā)現(xiàn)該患者外周血CD4+和CD8+T細胞數(shù)量明顯減少且處于過度激活狀態(tài)[58]。CD4+T細胞中高度促炎的CCR4+CCR6+Th17細胞頻率升高[58]。CD8+T細胞中含有高濃度的顆粒溶素及穿孔素等細胞毒顆粒。以上T細胞的過度活化，即Th17細胞的增加和CD8+T細胞的細胞毒作用是造成該患者嚴重免疫損傷的部分原因。通過對44例COVID-19患者外周血的淋巴亞群分析觀察到了類似的結(jié)果，即COVID-19患者外周血B細胞、T細胞和NK細胞總數(shù)較健康人明顯降低，且與非重癥組相比，重癥組該3類細胞總數(shù)下降更為明顯[60]。同時，COVID-19患者外周血輔助性T細胞(CD3+CD4+)和抑制性T細胞(CD3+CD8+)水平較健康人也明顯降低[60]。

另一項來自33位COVID-19患者的血液學數(shù)據(jù)顯示，相較于存活患者，死亡患者的中性粒細胞計數(shù)、D-二聚體、血尿素和肌酐水平持續(xù)升高，淋巴細胞計數(shù)持續(xù)下降[54]。中性粒細胞增多可能與病毒入侵引起的細胞因子風暴有關(guān)，凝血激活可能與持續(xù)性炎癥反應有關(guān)，而急性腎損傷可能與病毒、缺氧和休克的直接作用有關(guān)，以上免疫病理損傷可能與患者的死亡有關(guān)[54]。與健康人相比，SARS-CoV-2感染患者的血漿IL-1β、IL-1Ra、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、FGF、GCSF、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、IFN-γ、IP-10、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP1/CCL2)、CCL3/MIP1α、CCL4/MIP1β、血小板源生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、TNF-α和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平更高，其中高水平的IL-1β、IFN-γ、IP-10及MCP1可能導致活化的Th1細胞反應[50]。此外，ICU患者血漿IL-2、IL-7、IL-10、GCSF、IP-10、MCP1、MIP1α和TNF-α水平均高于非ICU患者[53]，這表明細胞因子風暴參與了疾病的進展。與SARS-CoV不同的是，SARS-CoV-2感染還啟動了發(fā)揮炎癥抑制作用的Th2型細胞因子，如IL-4和IL-10的分泌[50]。以上結(jié)果表明，免疫病理損傷在COVID-19的發(fā)生發(fā)展中也可能起到相關(guān)作用。

4 總結(jié)與展望

炎癥反應是消除病原體過程中不可缺少的一部分。炎癥反應通過識別病原體、調(diào)節(jié)相關(guān)細胞因子或趨化因子的分泌和表達，介導免疫細胞募集和浸潤，并最終達到消除病原體、修復組織及恢復機體穩(wěn)態(tài)的目的。然而，當如SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2這些高致病性病毒攻擊人體時，會導致過度或時間過長的細胞因子/趨化因子反應，免疫細胞功能受損、過度活化或凋亡等，上述一系列事件造成的免疫病理損傷導致了疾病的重癥化。鑒于目前沒有針對SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2的特異性抗病毒藥物，臨床治療中可以通過減少病毒誘導的直接細胞病變效應和抑制宿主炎癥反應的治療(例如通過中和細胞因子或其同源受體的抗體或化合物，如抗IL-6、抗IL-6R或抗IL-1β)，以減輕病毒感染過程中的免疫病理損傷。