鵝膏毒肽類毒素檢測方法的研究進(jìn)展

張曉萌，秦鳴蔚，趙新月，宋玉竹，張金陽，夏雪山，韓芹芹

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650500)

根據(jù)鵝膏肽類毒素氨基酸的組成和結(jié)構(gòu),鵝膏肽類毒素可分為鵝膏毒肽、鬼筆毒肽和毒傘素3類，其中鵝膏毒肽是一類雙環(huán)八肽。鵝膏毒肽化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐高溫、耐干燥和酸堿，一般的烹調(diào)加工不會破壞其毒性，該類毒素易溶于甲醇、乙醇和水，分子質(zhì)量在973～990 Da[1]。根據(jù)側(cè)鏈取代基團(tuán)不同鵝膏毒肽又可以分為α-amanitin、β-amanitin、γ-amanitin、∑-amanitin等，其半致死量分別為0.3、0.5、0.2和0.3 mg/kg。據(jù)報道，每年世界各地都有成千上萬的蘑菇中毒事件發(fā)生[2-6]，蘑菇中毒引起的死亡90%是由含鵝膏毒肽毒素的蘑菇導(dǎo)致[7]。當(dāng)人們誤食含有鵝膏毒肽的毒蘑菇時，會產(chǎn)生劇烈惡心、嘔吐、腹痛或腹瀉等情況，嚴(yán)重則會引起多器官衰竭進(jìn)而導(dǎo)致死亡[8-11]。研究表明，雖然現(xiàn)有多種針對鵝膏毒肽的檢測技術(shù)，但是這些檢測技術(shù)都存在一些弊端，如成本高、耗時長、需要專業(yè)的檢測儀器和檢測人員等。不同的檢測技術(shù)對蘑菇樣品前處理方式需求也不同，更重要的鵝膏毒肽在血漿和尿液中代謝較快，濃度較低，故很多能夠快速檢測蘑菇樣品中鵝膏毒肽的技術(shù)都無法運(yùn)用到臨床患者尿液和血液的快速檢測[12]。所以，建立快速檢測蘑菇、尿液和血漿中鵝膏毒肽的方法就顯得尤為重要。本文分別就現(xiàn)有的快速檢測蘑菇樣本中鵝膏毒肽和快速檢測血漿和尿液中鵝膏毒肽的技術(shù)進(jìn)行闡述和分析。

1 蘑菇樣本中鵝膏毒肽的快速檢測

1.1 超分支滾環(huán)擴(kuò)增(hyper-branched rolling circle amplification, HRCA)技術(shù)

與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)嚴(yán)格的程序升溫不同，HRCA技術(shù)是一種可以在恒溫條件下指數(shù)擴(kuò)增核酸信號的放大技術(shù)[13-14]，具有較高的擴(kuò)增效率和靈敏度[15]?，F(xiàn)已開發(fā)出許多基于HRCA技術(shù)的傳感器，用于超靈敏性檢測核酸。HE等[16]設(shè)計出一種針對鵝膏菌中α-amanitin基因序列的鎖式探針，并基于HRCA技術(shù)建立檢測方法。實驗中加入SYBR Green I為指示劑，雙鏈DNA與指示劑結(jié)合后增強(qiáng)熒光強(qiáng)度，可直接讀取實驗結(jié)果，無需瓊脂糖凝膠電泳。此方法的檢測限為100 copies/μL，是普通PCR方法的100倍，檢測結(jié)果可在3 h內(nèi)獲得，同時也可用于蘑菇混合物中鵝膏毒肽的檢測。該傳感器提供了一種靈敏、快速的鵝膏毒肽檢測方法，避免了農(nóng)村地區(qū)無法使用昂貴儀器的限制。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

ELISA是實驗室目前最為常用的檢測方法，這種方法主要是以抗原和抗體的特異性免疫結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，在特定標(biāo)記物如同位素、酶、熒光基團(tuán)等的配合下將免疫反應(yīng)擴(kuò)大，用于對特定靶標(biāo)的檢測。酶聯(lián)免疫反應(yīng)相比其他檢測方法具有特異性高、操作簡單、不需要特定儀器等優(yōu)點(diǎn)。

HE等[17]研究并制備出一種單克隆抗體，并利用其建立了一種利用間接競爭性免疫反應(yīng)檢測蘑菇樣品中鵝膏毒肽的方法。在整個免疫反應(yīng)中以α-amanitin與牛血清蛋白的偶聯(lián)物(α-amanitin-OVA) 作為包被抗原，以鵝膏毒素作為競爭抗原，初步建立了檢測蘑菇中鵝膏毒肽的間接ELISA。對蘑菇樣品中鵝膏毒肽進(jìn)行檢測分析發(fā)現(xiàn)，此方法對蘑菇樣品中α-amanitin、β-amanitin、γ-amanitin的檢測限分別為4.55、4.9和4.45 ng/mL。在此基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法對該蘑菇樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果表明2種方法之間具有較好的一致性。

BEVER等[18]開發(fā)了一種能同時檢測α-amanitin、β-amanitin和γ-amanitin的檢測技術(shù)，且檢測的同時不會與結(jié)構(gòu)類似物發(fā)生交叉反應(yīng)。低分子量的鵝膏毒肽本身不具有免疫原性，不能發(fā)生免疫反應(yīng)，但前期研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)鵝膏毒肽與大分子物質(zhì)如載體蛋白結(jié)合后，其結(jié)合物具備免疫原性?？衫?種不同的化學(xué)連接物質(zhì)構(gòu)建帶有不同免疫原性的鵝膏毒肽與載體蛋白的偶聯(lián)物，以達(dá)到產(chǎn)生與鵝膏毒肽結(jié)合的抗體目的，最終實驗結(jié)果表明,只有2種方式成功產(chǎn)生了結(jié)合游離鵝膏毒肽的抗體，其中一種是利用高碘酸鹽氧化這一新的連接方式，利用抗體建立競爭性酶聯(lián)免疫反應(yīng)，檢測限為1.0 μg/mL。由于利用單克隆抗體的ELISA更適用于檢測試劑盒，BEVER等[19]又制備出新的單克隆抗體(mAbs, AMA9G3和AMA9C12)。與多克隆抗體不同，單克隆抗體具有持久性和一致性[20]，從而克服了用于鵝膏毒肽檢測的商用多克隆抗體(pAb)供應(yīng)有限、不同批次有差別的難題，利用這一新的單克隆抗體建立的快速檢測鵝膏毒肽的ELISA，檢測限可以達(dá)到1 ng/mL。同時在檢測蘑菇樣品時,前處理方法簡單，以鵝膏菌為樣本，采用水等簡單溶劑快速(1 min)提取鵝膏毒肽，大大縮短和簡化了檢測的時間和流程。

綜上所述，ELISA具有操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于蘑菇樣品中鵝膏毒肽的檢測，根據(jù)ELISA原理開發(fā)的試劑盒將會大大縮短檢測時間，改善基層難以檢測的問題[21]。但是ELISA是一種利用抗原與抗體特異性結(jié)合的酶聯(lián)免疫反應(yīng)，在檢測前期需要購買或制備能與抗原特異性結(jié)合的抗體，故該方法存在費(fèi)用高、制備抗體耗時長等缺點(diǎn)。更重要的是雖然有許多ELISA試劑盒在市場上得到應(yīng)用，但是大多數(shù)在評估基質(zhì)效應(yīng)、有效樣品預(yù)處理的高交叉反應(yīng)性等方面受到限制，因此限制了其實際應(yīng)用，也不適用于檢測血漿和尿液中的鵝膏毒肽。

1.3 側(cè)流免疫層析法(lateral flow immunoassay, LFIA)

相比ELISA， LFIA具有使用簡單、成本低廉和檢測快速等優(yōu)點(diǎn)。LFIA是一種快速診斷方法，且適用于現(xiàn)場檢測，現(xiàn)已用于生物及食物安全檢測中[22]。雖然ELISA是實驗室常用的檢測技術(shù)，但是需要借助專業(yè)的試劑和設(shè)備，耗時也較長。如果將ELISA中使用的免疫試劑轉(zhuǎn)移到LFIA中將會解決以上問題。LFIA又被稱為橫向流動免疫檢測技術(shù)[23]，是以條狀纖維層析材料為固相，利用纖維層析材料上毛細(xì)管的吸附作用使滴在材料上的樣品向前移動，最終通過顯色反應(yīng)達(dá)到檢測樣品中是否存在待檢物的技術(shù)。在LFIA中，免疫反應(yīng)的發(fā)生可以基于抗原、抗體的特異性結(jié)合或核酸適配體和靶標(biāo)的特異性結(jié)合。近年來，一些與核酸適配體有關(guān)的腫瘤治療技術(shù)已經(jīng)在臨床上得到應(yīng)用[24]，核酸適配體的出現(xiàn)也使診斷研究發(fā)生了一定轉(zhuǎn)變，相較于抗體，核酸適配體對于側(cè)流免疫檢測平臺具有更好的無免疫原性及可標(biāo)記適用性[25]。傳統(tǒng)的LFIA主要分為雙抗夾心層析法和競爭免疫層析法。根據(jù)LFIA原理開發(fā)的免疫試紙條主要是由樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊和硝酸維生素膜等構(gòu)成，適用于大批量樣本的定性實驗[26]。

針對常規(guī)檢測鵝膏毒肽的方法設(shè)備昂貴或步驟繁瑣等弊端，BEVER等在上述酶聯(lián)免疫吸附法基礎(chǔ)上開發(fā)了一種競爭免疫層析法，他們將制備的單克隆抗體mAbs運(yùn)用到LFIA上，通過實驗確定LFIA檢測的特異性和靈敏性。檢測可在10 min內(nèi)完成，檢測結(jié)果可直接讀取，其方法對α-amanitin和γ-amanitin的檢測限都可以達(dá)到10 ng/mL。利用該LFIA對野生蘑菇進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果與液相色譜結(jié)果一致性較好[27]。該方法實現(xiàn)了快速、便捷、靈敏檢測蘑菇樣本中鵝膏毒肽的目的，在一定程度上解決了ELISA抗體制備耗時長、需要儀器測定和不適用于現(xiàn)場檢測等缺點(diǎn)，可用于大批量樣品中鵝膏毒肽的快速檢測[28]。

2 血漿和尿液中鵝膏毒肽的快速檢測

由于鵝膏毒肽在血漿和尿液中代謝較快、濃度較低，因此常規(guī)檢測蘑菇樣本中鵝膏毒肽的方法(如ELFIA、紫外-可見光吸收光譜技術(shù)等)都無法運(yùn)用到檢測血漿和尿液上。含有鵝膏肽類毒素蘑菇中毒病例具有較長的潛伏期(6～24 h)，大多數(shù)病例的潛伏期為十幾個小時[29]。因此一種能夠適用于臨床的快速檢測鵝膏毒肽的檢測方法就顯得尤為重要。

2.1 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)

GARCIA等[30]建立一種聯(lián)用二極管陣列和電化學(xué)檢測的HPLC技術(shù)。單一的HPLC技術(shù)限制了檢測鵝膏毒肽時的靈敏度，二極管陣列和電化學(xué)檢測法的聯(lián)用將會大大提高檢測范圍和準(zhǔn)確度。分別利用聯(lián)用二極管陣列檢測的HPLC和聯(lián)用電化學(xué)檢測法的HPLC技術(shù)對大鼠生物樣品(肝臟、腎臟)進(jìn)行鵝膏毒肽檢測，色譜檢測運(yùn)行時間在22 min內(nèi)，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),聯(lián)用電化學(xué)檢測法時檢測限更低，可達(dá)0.040 μg/mL。此外，研究還驗證了此方法可用于人體血漿中鵝膏毒肽的檢測。

2.2 液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)

MAURER等[31]將LC-MS運(yùn)用到人類尿液樣本中鵝膏毒肽的檢測，因LC-MS檢測方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，LC-MS技術(shù)已在血漿和尿液樣本檢測中得到普遍使用。眾所周知，如果將色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，被測樣品首先被色譜技術(shù)分離純化，純化后的樣品進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)，故二者聯(lián)用后會將色譜和質(zhì)譜的優(yōu)勢進(jìn)行互補(bǔ)，同時也會大大節(jié)省檢測時間。研究發(fā)現(xiàn)，不同的LC方法和MS方法組合會對檢測方法靈敏度的提高產(chǎn)生影響，現(xiàn)有更多的鵝膏毒肽檢測手段是在LC-MS檢測技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的[32]。

2.2.1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)

UPLC-MS/MS可同時測定尿液或血漿中的6種毒肽(α-amanitin、β-amanitin、γ-amanitin、phallisacin、phalloidin和phallacidin)[33]。該檢測方法的線性范圍為0.2～20 ng/mL，這6種毒肽的檢出限均低于0.06 ng/mL，在血漿和尿液基質(zhì)中的加標(biāo)回收率在79.6%～104.8%。

2.2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)

LC/MS技術(shù)雖然能夠高靈敏度、快速并定量地檢測鵝膏毒肽,但是存在一個明顯弊端,在定量分析時受待測樣品基質(zhì)中所含的鹽或其他共洗脫化合物影響較大，故該技術(shù)對樣品的制備要求較高。樣品制備優(yōu)化和調(diào)試色譜條件可減小基質(zhì)影響，但是最有效的手段是將一個同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)引入到實驗中，然而內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇也是檢測結(jié)果能否準(zhǔn)確的關(guān)鍵。ABBOTT等[34]首次將同位素標(biāo)記的15N10-α-amanitin，作為定量檢測尿液中鵝膏毒肽的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，實現(xiàn)了同時對尿液中α-amanitin、β-amanitin、γ-amanitin的定量檢測，三者檢測限分別為0.458/0.930和0.169 ng/mL。

2.2.3 高效液相色譜/三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用法(high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry, HPLC-MS/MS)

魏佳會等[12]建立了一種利用HPLC-MS/MS同時測定血漿和尿液中3類重要鵝膏毒肽類(α-amanitin、β-amanitin、phalloidin)、丙氨酸羥毒傘肽及二羥毒散肽等毒素的方法。此方法不僅可用于檢測蘑菇樣品中的鵝膏毒肽，也可用于檢測患者血液和尿液中的鵝膏毒肽，檢測時間為10 min左右。該方法對α-amanitin和β-amanitin在血漿和尿液中的檢測限均為0.5 μg/mL，線性范圍均為5～500 μg/mL，對二羥鬼筆環(huán)肽、丙氨酸羥毒傘肽及二羥毒散肽在血漿和尿液中的檢測限為0.2 μg/mL。該方法具有樣品需要量少、檢測速度快、靈敏度高、回收率高等特點(diǎn)，可大大改善血液和尿液中毒素基質(zhì)效應(yīng)大、檢測限高的問題。

雖然色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法檢測血漿和尿液樣本中鵝膏毒肽表現(xiàn)出諸多優(yōu)勢，但是依然需要借助于昂貴的設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，檢測成本較高，無法在現(xiàn)場檢測中應(yīng)用。

2.3 分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique, MIT)

大多數(shù)免疫反應(yīng)是基于抗原與抗體特異性結(jié)合產(chǎn)生的，與抗原-抗體特異性結(jié)合有著相似的性質(zhì)[35]，MIT是制備能與目標(biāo)分子在特定結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的聚合物，該聚合物被稱為分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer, MIP)，它有著特定的空間結(jié)構(gòu)和特異性識別能力。MIT具有高特異性、高穩(wěn)定性和高預(yù)定性，現(xiàn)已廣泛用于化學(xué)仿生傳感器[36]，實現(xiàn)了定量分析各種小分子有機(jī)化合物的目的，在食品安全檢測中有著重要應(yīng)用[37]。現(xiàn)介紹2種基于MIT建立的檢測血漿和尿液中鵝膏毒肽的化學(xué)傳感器。

2.3.1 分子印跡熒光傳感器

FENG等[38]將MIP的特異選擇性和碳量子點(diǎn)(carbon quantum dots, CDs)識別放大光學(xué)信號的優(yōu)勢結(jié)合，設(shè)計MIP-CDs熒光傳感器。在380 nm激發(fā)波長條件下進(jìn)行熒光測量，通過MIP-CDs發(fā)射強(qiáng)度的變化檢測血清中的鵝膏毒肽，其中MIP-CDs新型傳感器的最佳響應(yīng)時間為20 min，α-amanitin的檢測限為15 ng/mL，在0.05～4.0 μg/mL范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度和α-amanitin濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，樣本回收率為97.8%～100.9%。實驗結(jié)果表明該傳感器具有較高的靈敏度和選擇性，更重要的是樣本無需經(jīng)過任何預(yù)處理，即可達(dá)到快速檢測血清中鵝膏毒肽的目的。

2.3.2 分子印跡光子晶體(molecularly imprinted photonic crystal, MIPC)傳感器

QIU等[39]利用具有可見顏色的光子晶體完成傳感器中信號轉(zhuǎn)換工作，制備MIPC傳感器。該傳感器可用于實際樣本(蘑菇、尿液和血清)中鵝膏毒肽的檢測，檢測限為5.0×10-10mg/L，線性范圍為10-9～10-3mg/L，僅需要2 min的響應(yīng)時間，實際樣本的檢測結(jié)果會出現(xiàn)明顯的衍射峰紅移和顏色變化。

基于MIT建立的傳感器在一定程度上改善了LC-MS中樣品前處理程序繁雜的問題，簡化了實際樣本的檢測步驟。

2.4 免疫層析試紙條

BEVER等[40]根據(jù)LFIA開發(fā)的免疫試紙條，檢測人類和狗的尿液中的鵝膏毒肽，α-amanitin和γ-amanitin檢測限可達(dá)10 ng/mL，β-amanitin的檢測限可達(dá)100 ng/mL，檢測結(jié)果可直接由肉眼讀取，檢測時間為10 min。這證明了LFIA不僅可用于蘑菇樣本中鵝膏毒肽的檢測，也可用于尿液中鵝膏毒肽的快速檢測。

3 結(jié)語

鵝膏毒肽作為一種具有劇毒性質(zhì)的物質(zhì)，為監(jiān)管其在食品領(lǐng)域的安全，越來越多鵝膏毒肽的檢測方法被研究報道。由于蘑菇樣本、血漿和尿液等的特殊性，許多檢測方法無法應(yīng)用，鵝膏毒肽的快速檢測方法還面臨著一定的困難。HRCA和MIT為我們建立新方法開拓了思路，在一定程度上解決了某些地區(qū)無法使用昂貴儀器的問題。但是，這2種技術(shù)仍需要專業(yè)的技術(shù)人員和技術(shù)操作，很難實現(xiàn)檢測技術(shù)的廣泛使用。近年來，ELISA檢測蘑菇樣本中的鵝膏毒肽越來越普遍，此方法具有操作簡單的特點(diǎn)，同時為之后商業(yè)化鵝膏毒肽檢測試劑盒的生產(chǎn)提供了技術(shù)支持，但ELISA的穩(wěn)定性還需要進(jìn)一步提高。雖然現(xiàn)在用于人體血漿和尿液樣本中鵝膏毒肽的快速檢測方法還多為色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法，受到昂貴實驗儀器、設(shè)備和專業(yè)技術(shù)水平的限制。但是隨著簡便、快速、適用于大量樣本的LFIA不斷發(fā)展，會為臨床建立更加便捷的、適用于現(xiàn)場的鵝膏毒肽檢測方法提供重要的技術(shù)手段。