白酒菌種庫功能菌評價方法的建立以及白酒“綿柔因子”生成菌劑的研發(fā)與應用

范 鏖，楊 濤

（中國科學院成都生物研究所，四川成都 610041）

中國白酒是傳統(tǒng)發(fā)酵飲品，自然發(fā)酵、多微共酵的傳統(tǒng)工藝使微生物菌群和發(fā)酵過程都較為復雜。研究功能性成分、特征風味成分及其形成的代謝機制，了解主要功能微生物的代謝規(guī)律及關鍵微生物相互作用機制，進而定向選育功能微生物、開發(fā)新型復合微生物菌劑實現(xiàn)自動化、智能化生產，使傳統(tǒng)釀造由經驗型向現(xiàn)代化、科學化轉變，這是傳統(tǒng)釀造食品發(fā)展的必然趨勢，而這些研究都需建立在釀造微生物菌株的獲得及其功能解析的基礎上，因而釀造功能微生物菌種資源的篩選與應用是傳統(tǒng)釀造食品升級改造的基礎和核心。

中國科學院成都生物研究所從20世紀70年代末期就非常重視白酒釀造微生物菌種資源的分離收集，吳衍庸[1]老師在己酸菌、產甲烷菌及放線菌方面進行了開創(chuàng)性的研究，名酒組其他老師在酵母菌、根霉、紅曲霉、芽孢桿菌等方面也開展了許多篩選與應用研究。在以傳統(tǒng)微生物分離方法基礎上，對于一些難培養(yǎng)、生長慢或者營養(yǎng)要求比較特殊的菌株，研究采用基于高通量測序的宏基因組學技術解析傳統(tǒng)釀造食品微生物多態(tài)性和優(yōu)勢微生物演變規(guī)律，建立關鍵菌株可培養(yǎng)分離技術、特色菌株篩選模型。幾十年的積累，從傳統(tǒng)白酒釀造物料（曲藥、糟醅、窖泥等）分離篩選了濃香、醬香、清香等不同香型的曲藥、糟醅、窖泥等微生物菌種資源。系統(tǒng)分離保藏了清香、濃香、醬香等不同香型關鍵工序釀造功能微生物菌種約900株。基于這些菌種資源構建的窖泥功能菌劑、嗜熱芽孢桿菌菌劑、麩曲醬香功能菌劑及芝麻香功能菌劑在多個企業(yè)應用取得了顯著的效果。

在建設和維護菌種庫的同時，我們進一步研究菌種功能評價技術體系，針對白酒行業(yè)技術進步和市場變化的趨勢，組合出不同功能的功能菌菌劑，希望能更加充分地發(fā)揮菌種庫的作用。本文即是菌種庫功能菌評價方法的建立，以及應用這種方法，研發(fā)白酒“綿柔因子”生成菌劑的報告。

在實驗室建立以五糧為原料，以自制米曲、大曲、小曲為發(fā)酵劑的白酒發(fā)酵基礎系統(tǒng)，再向其中添加菌種庫中不同功能菌的純種或組合菌劑，以產酒的理化指標和嘗評結果，對不同功能菌的純種或組合菌劑做出性能評價[2-4]。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：霉菌(白曲霉Z#、黃曲霉Q#)；酵母菌(產酒酵母L#、產香酵母L1#)。

曲樣：大曲，取自正常生產大型酒企；小曲，外購安琪甜酒曲。

原料：取自正常生產大型酒企的大米、高粱、玉米（粉碎）、糯米、小麥。

1.2 實驗方法

1.2.1 使用米曲為糖化發(fā)酵劑的實驗方法

1.2.1.1 制作米曲（白曲米曲和黃曲米曲方法一致）

把大米洗3遍，加水至浸沒大米5 cm處浸泡45 min，然后瀝干0.5 h，蒸煮45 min，攤冷至30 ℃左右，得到水分為30 %～35 %的蒸米，分裝于淺盤，無菌條件下接入菌種孢子懸液（孢子數(shù)1×105個/g大米），置于相對濕度95 %、28～30 ℃培養(yǎng)箱中堆積培養(yǎng)。16～20 h期間，溫度上升至44～48 ℃時，攤開混合、降溫后再堆積1次；溫度上升至40～44 ℃再次攤開混合，控制溫度36～40 ℃；至36 h時再翻動1次，控制溫度32～36 ℃；至40 h時，除去濕度，32～34 ℃通風干燥培養(yǎng)至總時間為44～46 h，可直接出曲使用。

也可在40～45 ℃烘干1 d，最后水分含量為16%左右，低溫保藏備用。優(yōu)質曲為物料表面及內部長滿白色菌絲，無或少見孢子著生，無雜色，口嚼酸甜味明顯。

1.2.1.2 酒母的制作

米曲汁培養(yǎng)基調至Brx 10%，取適量放入三角瓶中，121 ℃、15 min濕熱滅菌并冷卻后，分別挑取L#和L1#菌株2%YPD培養(yǎng)基上的新鮮酵母菌苔1環(huán)接入，25 ℃恒溫條件下，靜置培養(yǎng)2 d。即可得到產酒酵母L#和產香酵母L1#的酵母菌培養(yǎng)液。

1.2.1.3 種子培養(yǎng)

發(fā)酵用曲量以33 %作為基準，稱取所需米曲165 g放入500 mL三角瓶中，按米曲的120 %添加量加入200 mL水，再加入酒母至細胞濃度106cell/mL（其中，產酒酵母L#∶產香酵母L1#=2∶1），混合均勻后，25 ℃靜置培養(yǎng)3～6 d。

1.2.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

1.2.1.4.1 原料的浸泡和蒸煮

大米：將大米稱量后用自來水清洗1～2次，加入2～3倍大米質量的水于常溫下浸泡15～16 h，過濾后于常壓蒸煮器中進行蒸煮。上氣后蒸煮時間為30～40 min，中間每10 min淋水翻拌1次，以米粒熟透、不黏手為準。

高粱：稱量后用自來水清洗1～2次，冷水條件下浸泡1 d，再蒸煮2 h。蒸煮過程中淋水2～3次。

玉米：將粉碎后的玉米渣先在常溫下浸泡12 h，后加溫至65 ℃，保溫4～5 h。換水，在常溫下再浸泡12 h。經反復浸泡，冷熱交替處理，讓緊密的玉米淀粉吸水膨脹，吸收足夠的水分，易于蒸煮。蒸煮時將玉米糝放入鍋內，當加熱至蒸汽冒出后，加蓋蒸2 h，方便原料蒸透，中途淋水2～3次，每次要淋透。

糯米：糯米除雜，洗凈，保持水面浸沒糯米上層10 cm，常溫下浸泡15～16 h，至米粒用手碾之即碎；蒸煮時，上氣后蒸煮時間為20～30 min，有米飯香味即可，要求熟而不爛，透而不爛，外硬內軟，疏松易散，均勻一致；將蒸好的飯放于紗布上，用無菌水沖冷，要邊拌邊淋，使米飯快速降溫至35 ℃左右，避免因緩慢冷卻導致微生物污染。

小麥：小麥除雜、清洗后，常溫下浸泡12 h（至5 %～7 %的水分，浸泡時間太長可能發(fā)芽），用手動壓面機壓至扁平狀，使心爛皮不爛；壓榨后的小麥質地較疏松，置于常壓蒸煮器中進行蒸煮，上氣后蒸煮時間為40～50 min，中間淋水翻拌1次，以小麥熟稔、芯熟透為準。

1.2.1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)

種子糟全部移入2000 mL三角瓶中，加入蒸煮后的發(fā)酵原料500 g，再按照發(fā)酵原料的180%量加入900 mL發(fā)酵用水，28 ℃恒溫培養(yǎng)，在培養(yǎng)的過程中，每天稱重三角瓶的重量1次，記下稱重的時間和重量，到三角瓶的重量不再發(fā)生變化或者變化很小來確定發(fā)酵完畢，需要8～9 d。

1.2.1.5 蒸餾

發(fā)酵完畢后進行蒸餾，測定酒精度、同時制作樣品進行色譜分析，對各酒樣進行嘗評。

1.2.2 使用小曲為糖化發(fā)酵劑的實驗方法

大米、玉米、糯米、小麥分別按照1.2.1.4.1的方式進行浸泡、蒸煮后，攤晾至30 ℃左右，按照1%添加量拌入小曲，再添加原料200 %量的發(fā)酵用水。混合均勻，置于28 ℃恒溫室中進行發(fā)酵培養(yǎng)。

培養(yǎng)過程中觀察產氣量變化，根據(jù)不同樣品的發(fā)酵狀況，發(fā)酵完畢后進行蒸餾，得到各原料的小曲發(fā)酵酒。

1.2.3 使用大曲為糖化發(fā)酵劑的實驗方法

高粱浸泡、蒸煮后，使用7%～8%的大曲作為糖化發(fā)酵劑，發(fā)酵期可延長至30 d。目前實驗結果顯示，實驗室大曲發(fā)酵容易感染雜菌，尚不斷摸索新的實驗方法。

綜合上述實驗方案，具體的實驗組數(shù)如圖1。

2 結果與分析

2.1 產氣量變化

2.1.1 小曲發(fā)酵樣品的產氣量變化

糯米、玉米、大米和小麥分別稱取500 g進行發(fā)酵，以1 %小曲為發(fā)酵劑，各發(fā)酵樣品的產氣量變化趨勢如圖2。

圖1 實驗組數(shù)安排方案

圖2 各原料小曲發(fā)酵樣品產氣量變化

由于各原料的淀粉含量不同，因此其理論產氣量也各不相同。參考相關文獻資料，糯米淀粉含量以78%計、玉米淀粉含量為70%、大米為75%、小麥為60 %，分別以此數(shù)據(jù)計算各發(fā)酵樣品的理論產氣量和理論產酒量。以500 g原料進行產酒試驗，各樣品的理論產氣量分別為糯米209 g、玉米188 g、大米201 g、小麥161 g。

由圖2可以看出，各發(fā)酵樣品的產氣趨勢均為由慢到快再緩慢的過程，在5～15 d產氣最為迅速，之后逐漸趨于平緩，發(fā)酵20 d以后的各樣品產氣量變化不大，后期主要是呈香呈味物質的積累過程。

對比來看，糯米、大米和小麥發(fā)酵樣品的產氣情況較好，而玉米發(fā)酵樣品的產氣量遠遠低于理論值，其發(fā)酵情況不太好，分析其原因主要有兩個方面：(1)粉碎度不夠；(2)玉米未脫胚，影響產酒和口感。在之后的實驗中可對不足之處進行改進。

2.1.2 米曲發(fā)酵樣品的產氣量變化（圖3）

分別以白曲米曲和黃曲米曲為糖化發(fā)酵劑，300 g大米為發(fā)酵原料，兩個樣品的產氣量變化如圖3所示。其中大米淀粉以75 %、米曲淀粉以60 %計，以此計算出理論產氣量為152.9 g。實際產氣量相當接近理論值，發(fā)酵效果較好。

2.2 產酒情況

2.2.1 小曲發(fā)酵樣品的產酒量對比

以500 g原料進行發(fā)酵，各樣品分別發(fā)酵20～25 d后，進行常壓蒸餾。見表1。

圖3 米曲發(fā)酵樣品的產氣量變化

根據(jù)各原料的實際產酒狀況，在提高酒度的前提下采取分段接酒的方式，對不同酒度的酒進行分別接收和貯存。糯米和大米由于其淀粉含量均較高，因此分別得到了400 mL的高度酒，小麥和玉米分別得到了300 mL酒度較高的酒樣。

糯米酒的酒度高達50.3 %vol，大米酒和小麥酒分別達到48.6 %vol和47.0 %vol，產酒力均達到75%以上，發(fā)酵產酒情況良好。對比來看，玉米酒的酒精度為30.0 %vol，同時產酒力僅為40.26 %，遠遠低于其他樣品，其產酒效果不佳，應該主要是與玉米的粉碎度和未脫胚有關。

2.2.2 米曲發(fā)酵樣品的產酒量對比

使用300 g大米為發(fā)酵原料，大米白曲和大米黃曲樣品分別發(fā)酵13 d后，進行常壓蒸餾。見表2。

按照大米淀粉含量75%、米曲淀粉含量60%，以此計算出理論產乙醇量為159.90 g。由表2數(shù)據(jù)來看，大米黃曲和大米白曲發(fā)酵樣品的產酒情況一樣，分兩段接酒，頭段酒精度高達55.2 %vol，總產酒力為90.46%，酒精得率很高。

2.3 菌種庫菌種發(fā)酵功能測評

菌種庫不同菌種，以最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，培養(yǎng)出活力旺盛的菌液。在以五糧為原料的，以自制米曲、大曲、小曲為發(fā)酵劑的白酒發(fā)酵基礎系統(tǒng)中，以純種或組合菌劑的方式，在試驗開始時以總量5%為標準加入，在試驗完畢后以蒸餾產酒的理化指標和嘗評結果，對不同功能菌的純種或組合菌劑做出性能評價。

3 結論與討論

用上述菌種功能評價技術方法，對菌種庫功能菌的篩查中，發(fā)現(xiàn)有10多種原核和真核微生物功能菌，所產酒與對照比較，口感綿柔程度增加顯著，聞香也更加優(yōu)雅、細膩。在多次重復后，初步確定了白酒“綿柔因子”生成菌劑的微生物組成，并在川法小曲的生產中，進行了放大實驗。實驗樣酒經過白酒專業(yè)評委和數(shù)家酒企主管技術領導的嘗評驗證，確認了口感綿柔程度增加顯著，聞香也更加優(yōu)雅、細膩。下一步工作，一則在濃香型、清香型、醬香型生產企業(yè)進一步驗證白酒“綿柔因子”生成菌劑的作用，二則開展酒體香味成分的對比檢測分析，爭取找到白酒“綿柔因子”的具體成分。

表1 各小曲發(fā)酵樣品的產酒對比

表2 米曲發(fā)酵樣品的產酒對比

白酒功能菌菌種庫是珍貴的科研和生產應用技術資源，在建設和維護菌種庫的基礎之上，開發(fā)了菌種功能評價方法，即在實驗室建立以五糧為原料的，以自制米曲、大曲、小曲為發(fā)酵劑的白酒發(fā)酵基礎系統(tǒng)，再往里面添加菌種庫不同功能菌的純種或組合菌劑，以產酒的理化指標和嘗評結果，對不同功能菌的純種或組合菌劑做出性能評價。針對目前市場變化，對菌種庫菌種性能評價中，我們特意篩選出能明顯增加酒體口感綿柔程度和聞香優(yōu)雅程度的一組功能菌菌劑，在川法小曲的放大生產中，獲得初步成功。后續(xù)研究中，既要在不同香型酒企生產中進一步驗證這組“綿柔因子”生成菌劑對口感、聞香的作用，又要通過對實驗樣酒的成分檢測分析，爭取在“綿柔因子”具體成分研究上獲得進一步成果。