VEGF-A和VEGFR-2基因多態(tài)性對嬰幼兒血管瘤患病風險的影響

李 蕾，梁 巍，陳 琛，張紅鵬

(1.河北省人民醫(yī)院 a.小兒外科,b.病理科，石家莊 050000； 2.邯鄲市第七醫(yī)院普外科，河北 邯鄲 056000)

血管瘤是嬰幼兒時期常見的良性腫瘤之一，好發(fā)于頭、面、頸、會陰等重要部位，部分患兒病變范圍廣[1-2]。大部分血管瘤病變可隨患兒生長發(fā)育自行消退，且病變消退過程對患兒生命健康無危害，但部分大面積血管瘤完全消退后會出現患處皮膚松軟下垂、色素改變、淺表瘢痕等，對患兒及其家長心理產生一定的負面影響，不利于患兒早期的身心健康[3]。血管瘤常出現于患兒出生時或出生后數天至數周，早期出現內皮細胞的迅速惡性增殖，表現為逐漸突出于皮膚表面的紅色斑塊及皮下青紫色包塊，隨著患兒的生長發(fā)育可發(fā)生自發(fā)消退，具有一定的自限性[4]。血管瘤的治療方式多種多樣，在血管瘤藥物治療中，最常用的治療藥物為普萘洛爾，療效較確切，但可出現一定的不良反應，長期服用可出現心率減慢、心律失常、低血壓、低血糖、支氣管痙攣等嚴重并發(fā)癥[5]。研究指出，普萘洛爾的規(guī)范治療可明顯縮短嬰幼兒血管瘤的自然病程，具有良好的臨床耐受性，住院期間密切觀察患兒病情變化，及時處理并發(fā)癥，可顯著改善患兒病情并緩解患兒家長的焦慮情緒[2]。普萘洛爾通過抑制血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達抑制血管瘤內皮細胞的增生，進而減少內皮細胞的遷移和血管增生，誘導內皮細胞凋亡，抑制血管的生成，從而抑制血管瘤的進展[6]。目前，嬰兒血管瘤的發(fā)病機制尚未明確，但有研究表明，VEGF/血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)等多種信號轉導途徑與血管瘤的發(fā)病機制密切相關[7]。VEGF-A被認為是VEGF家族最重要的因子之一，不僅可生理性的促進血管形成，還在惡性腫瘤等疾病的進展過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。本研究旨在探討VEGF-A(+405G/C，rs2010963；+936C/T，rs3025039)及VEGFR-2(+1416T/A，rs1870377；-271G/A，rs7667298)的基因多樣性與嬰幼兒血管瘤患病風險的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年12月至2018年12月在河北省人民醫(yī)院小兒外科入院治療的58例血管瘤患兒作為觀察組，選取同期58名健康嬰幼兒作為對照組。納入標準：①觀察組血管瘤診斷明確；②入院前未接受其他治療。排除標準：①合并肺炎、氣管炎及哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病或合并急性充血性心力衰竭等心血管系統(tǒng)疾病；②并發(fā)肝腎功能不全、其他惡性腫瘤等疾病病史；③出生時合并新生兒窒息或新生兒缺血缺氧性腦??；④參與者臨床資料不完整或依從性差。兩組性別、年齡、體重比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。本研究經河北省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有受試者家屬均簽署知情同意書。

表1 兩組受試者一般資料比較

對照組：健康嬰幼兒；觀察組：血管瘤患兒；a為χ2值，余為t值

1.2方法 測定VEGF-A和VEGFR-2的基因多樣性，所有受試者在入院時抽取空腹靜脈血10 mL，置于枸櫞酸鈉抗凝管中并在4 ℃冰箱中保存。在血液樣本收集完成的1周內，應用蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析法提取受試者外周血白細胞DNA。

采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)方法擴增提取DNA，隨后由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成引物。具體方法如下：①PCR反應體系：dNTPs 10 mmol/L，上游及下游引物各10 pmol/μL，PCR緩沖液2.4 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 2.0 μL。應用PCR擴增儀(PT-100型)進行擴增。反應條件：94 ℃預變性3 min，隨后按94 ℃變性30 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，進行35個循環(huán)后，在72 ℃延伸10 min。②PCR產物電泳檢測反應結束后，將產物置于 0.5×TBE電泳液中，在100 V恒壓水平電泳30 min，檢測是否有特異性擴增產物產生。③限制性內切酶片段長度多態(tài)性分析：PCR酶切產物加入2%瓊脂糖凝膠加樣孔中，置于0.5×TBE電泳液中，在120 V恒壓水平電泳30 min，隨后取出放置于紫外光凝膠成像系統(tǒng)下觀察帶型，并將PCR產物純化后測序。

2 結 果

2.1兩組VEGF-A +405G/C和VEGF-A +936C/T位點的基因型和等位基因頻率分布比較 觀察組VEGF-A +405G/C、VEGF-A +936C/T的基因型頻率以及G和T等位基因的基因頻率均較對照組高(P<0.05)，見表2。

2.2兩組VEGR2 +1416T/A 和VEGR2 -271G/A位點基因型和等位基因頻率分布比較 觀察組VEGR2 +1416T/A和VEGR2 -271G/A的基因型頻率均較對照組高(P<0.001)；但觀察組T和G等位基因的基因頻率較對照組低(P<0.05)，見表3。

3 討 論

隨著社會的發(fā)展和醫(yī)療技術的進步，目前嬰幼兒血管瘤的治療方法較多，逐漸多樣化，主要分為非手術治療和手術治療，其中非手術治療包括激光治療、放射性核素及藥物治療等[9-11]。非手術治療作為血管瘤的首選治療方案，對大部分血管瘤患兒有效，但對一部分患兒的治療效果欠佳，往往需要進一步的手術治療消除病灶，增加了患兒和家長的心理壓力以及家庭的經濟負擔[12]。

大量嬰幼兒血管瘤相關研究報道了其發(fā)病機制的新發(fā)現，但具體分子機制尚不清楚[4,9-10]。VEGF/VEGFR-2信號通路在血管瘤發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，因此對影響VEGF和VEGFR的相互作用因素及其蛋白質表達水平的研究逐漸成為研究熱點[13]。研究發(fā)現，增殖期血管瘤組織VEGF信使RNA的表達水平明顯高于正常組織和消退期血管瘤組織[10]。另有研究發(fā)現，血管瘤組織分離培養(yǎng)的內皮細胞的VEGFR和血管生成素受體的表達水平明顯高于正常組織分離的內皮細胞，提示血管瘤組織內VEGF和血管生成素受體的過表達可能是血管瘤的形成機制之一[11]。VEGF-A通過與內皮細胞表達的酪氨酸激酶受體VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)和VEGFR-3(Flt-4)的特異性結合發(fā)揮特定作用，其中VEGFR-2在血管生成和通透性增加過程中的作用最重要[14-15]。研究表明，與消退期相比，增殖期血管瘤患者血清VEGF-A的表達水平明顯更高[16]。體外研究也表明，血管瘤內皮細胞、血管瘤干細胞和血管瘤周細胞中VEGF的表達水平明顯高于正常組織細胞[17]。VEGF基因存在多個位點的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，位于基因啟動子或調節(jié)區(qū)域的SNP，可影響轉錄過程，進而影響蛋白表達，導致疾病易感性的個體差異[18]。

本研究中，VEGF-A 的SNP，即+405G/C(在5′非翻譯區(qū))和+936C/T(在3′非翻譯區(qū))，既往研究指出，+405G/C和+936C/T可顯著影響VEGF的表達水平[19]。VEGF表達失調不僅與腫瘤疾病的發(fā)病機制密切相關，還與心血管疾病、子宮內膜異位癥等疾病的發(fā)病機制密切相關[20-21]。本研究結果顯示，健康兒童VEGF-A +405G/C和VEGF-A +936C/T的基因型頻率為34.5%和29.3%，與Przewratil等[22]關于VEGF-A的+405G和+936C/T SNP位點GC與CT基因型頻率大致相同的研究結論一致。本研究中，觀察組血管瘤患兒的VEGF-A +405G/C、VEGF-A +936C/T、VEGR2 +1416T/A和VEGR2 -271G/A SNP位點基因型和等位基因頻率與對照組兒童比較均存在差異，說明VEGF-A和VEGFR-2的基因多樣性在血管瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起主要作用，可能與基因的轉錄過程有關，影響靶基因的蛋白表達。

表2 兩組VEGF-A +405G/C和VEGF-A +936C/T位點基因型和等位基因頻率分布比較 [例(%)]

對照組：健康嬰幼兒；觀察組：血管瘤患兒；a為χ2值，余為t值

表3 兩組VEGR2 +1416 T/A和VEGR2 -271 G/A位點基因型和等位基因頻率分布比較 [例(%)]

對照組：健康嬰幼兒；觀察組：血管瘤患兒；a為χ2值，余為t值

通過測定血管瘤患兒外周血清VEGF和VEGFR-2信使RNA的表達水平檢驗基因多態(tài)性與細胞因子表達水平相關性研究顯示，+405G/C和+936C/T基因多態(tài)性個體血清的VEGF-A信使RNA表達水平明顯高于對照組，且存在+405G/C基因多態(tài)性的GG純合子個體的血清VEGF-A信使RNA表達水平最高[23]。

目前，對血管瘤發(fā)生和發(fā)展中VEGFR-2基因多態(tài)性的作用仍存在很大爭議。血管瘤的病理學特點是血管內皮細胞增殖活躍，并伴有血管生成和肥大細胞的廣泛聚集，而VEGFR-2是蛋白酪氨酸激酶家族成員之一，具有蛋白酪氨酸激酶結構域，可與VEGF結合激活相關信號通路，調控細胞的生物學行為[21]。一項橫斷面研究發(fā)現，普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤取得了滿意的治療效果，但血管瘤患兒和健康對照組嬰幼兒在治療前和治療后血清VEGFR-2表達水平的變化差異均無統(tǒng)計學意義[24]。研究指出，VEGFR-2過表達對血管瘤內皮細胞磷酸化過程起重要作用[25]；動物實驗研究發(fā)現，敲除VEGFR-2基因可明顯抑制大鼠血管瘤內皮細胞的增殖過程[26]。有研究指出，VEGFR-2在血管瘤組織增生期的表達水平明顯高于消退期；與消退期血管瘤組織和正常組織相比，血管瘤組織VEGFR-2基因上游啟動子序列存在異常甲基化，進一步說明VEGFR-2基因的多樣性，且VEGFR-2基因的異常甲基化可能在血管瘤組織發(fā)生、增殖及消退過程中發(fā)揮重要作用[27]。以上研究均表明，VEGFR-2的高表達及基因多態(tài)性在血管瘤發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。由于本研究樣本量較少，存在一定的局限性，研究結果可能存在一定偏倚，仍需要多中心大樣本臨床回顧性研究的進一步驗證。

綜上所述，VEGF-A和VEGFR-2的基因多態(tài)性與嬰幼兒血管瘤患病風險存在相關性，VEGF-A和VEGFR-2的基因多樣性可能是嬰幼兒血管瘤發(fā)病的危險因素之一，通過對血管瘤易感人群的篩選以及疾病預防、早期診斷和早期干預的分子水平研究，有望提高血管瘤的治愈率，從而改善血管瘤患兒的預后。