固相萃取聯(lián)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定畜肉中3 種兒茶酚胺類物質(zhì)

任 南，趙文濤，陳 超*，吳彥超，張穎穎，李瑩瑩，郭文萍，范 維，王守偉

（中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

兒茶酚胺類是一種含有兒茶酚和胺基的物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為都有一個(gè)雙羥基苯核和一個(gè)帶氨基的側(cè)鏈[1-2]。腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、腎上腺酮、多巴胺及相關(guān)衍生物均屬于兒茶酚胺類[3-5]。兒茶酚胺類是體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與多種生理、病理現(xiàn)象密切相關(guān)，在機(jī)體維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用[6-9]。兒茶酚胺類物質(zhì)互相之間有著緊密的聯(lián)系，受多種因素調(diào)節(jié)[10-12]。自20世紀(jì)60年代，腎上腺素類藥物一直被認(rèn)為是增加恢復(fù)心跳機(jī)會(huì)的特效藥[13]，腎上腺素類藥物讓人產(chǎn)生巨大的爆發(fā)力，為常用急救藥物，但過(guò)量則可引起中毒，不良反應(yīng)包括頭痛、焦慮不發(fā)、煩躁、面色蒼白、眩暈、多汗、心跳異常增快等，嚴(yán)重者引發(fā)胸痛和心律失常，甚至死亡[14-16]；早在1963年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用如咖啡因和腎上腺素等β受體激動(dòng)類物質(zhì)，可以促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)。此后越來(lái)越多的β受體激動(dòng)劑（瘦肉精）被研發(fā)出來(lái)，后因殘留對(duì)人體產(chǎn)生危害而被禁止[17-19]。

近年來(lái)，注水肉問(wèn)題受到越來(lái)越多的消費(fèi)者及監(jiān)管部門(mén)的關(guān)注。不法分子為了謀取暴利，將兒茶酚胺類藥物和水一同注入生豬體內(nèi)，生豬服用兒茶酚胺類藥物后口渴感增強(qiáng)，提高注水量，宰殺后不僅增重而且豬肉顏色鮮紅，易于出售[20]。導(dǎo)致近幾年注水肉屢禁不止的主要原因是注水肉的關(guān)鍵判定指標(biāo)不明確，注水肉的生物屬性或理化屬性研究滯后[21]。我國(guó)對(duì)豬肉中兒茶酚胺類藥物的檢測(cè)方法鮮見(jiàn)報(bào)道，因此研究豬肉中兒茶酚胺類藥物的檢測(cè)方法迫在眉睫，檢測(cè)方法的建立不僅為探索注水肉的關(guān)鍵指標(biāo)提供依據(jù)，而且為監(jiān)管部門(mén)打擊違法行為提供有力手段。

20世紀(jì)40年代便有學(xué)者對(duì)兒茶酚胺進(jìn)行分析研究，測(cè)定方法主要是乙二胺縮合法和三羥基吲哚法[22]。隨著新技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了多種測(cè)定方法，如化學(xué)發(fā)光法、熒光光譜法、電化學(xué)法、免疫分析法、質(zhì)譜法以及各種色譜法和多種方法聯(lián)用等[23-30]。兒茶酚胺的研究多集中于血漿、尿液樣本的檢測(cè)[31-33]，肉類樣品基質(zhì)復(fù)雜，兒茶酚胺類物質(zhì)易受到樣品的干擾[3]，因此如何排除樣品的干擾，是畜肉中兒茶酚胺類物質(zhì)測(cè)定的難點(diǎn)。目前兒茶酚胺類物質(zhì)多用高效液相色譜-電化學(xué)法檢測(cè)，但存在樣品前處理時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、存在干擾等問(wèn)題[34]，而且大多針對(duì)體液樣品。隨著分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，固相萃取聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)運(yùn)而生，固相萃取技術(shù)是利用選擇性吸附和選擇性洗脫的液相色譜分離原理，以達(dá)到快速分離、提取、富集目標(biāo)化合物的一種預(yù)處理技術(shù)。固相萃取技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、精確、使用溶劑少、回回率高、易于和其他儀器聯(lián)合使用等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域[35]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜具有檢測(cè)時(shí)間短、樣本用量小、靈敏度和特異性高的優(yōu)點(diǎn)[36]。因此選用固相萃取與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，旨在建立一種檢測(cè)畜肉中兒茶酚胺類藥物的靈敏和特異性的方法，并對(duì)方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腎上腺素（純度99.4%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；去甲腎上腺素（純度98%） 上海阿拉丁公司；異丙腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%），乙腈、甲醇（均為色譜純） 上海發(fā)譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；高氯酸（優(yōu)級(jí)純）、氨水（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水無(wú)特殊說(shuō)明均為一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

1290超高效液相色譜儀、6470三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；CR21N離心機(jī) 日本Hitachi公司；S-100渦旋儀、SR-IIw振蕩器 日本Taiyo公司；ABM-2均質(zhì)機(jī) 株式會(huì)社日本精機(jī)制作所；Milli-Q純水儀 美國(guó)Millipore公司；Cleanert PCX固相萃取柱博納艾杰爾公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取10 mg固體標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL燒杯中，加適量0.4 mol/L高氯酸溶解，并用0.4 mol/L高氯酸溶液轉(zhuǎn)移并定容至100 mL容量瓶中，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃以下冰箱中避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，用一級(jí)水配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品提取與凈化

提?。悍Q取試樣2 g（精確至0.001 g）于100 mL離心管中，加入10 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液，15 000 r/min均質(zhì)2 min，再用10 mL 0.4mol/L高氯酸溶液清洗刀頭，12 000 r/min離心15 min，上清液轉(zhuǎn)移至另外一離心管中，殘?jiān)偌尤?0 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液，15 000 r/min勻漿2 min進(jìn)行2 次提取，12 000 r/min離心10 min合并2 次提取溶液，待凈化。

凈化：Cleanert PCX柱使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水、5 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液活化，取提取液10 mL至Cleanert PCX柱，以1 mL/min通過(guò)PCX小柱后，分別用5 mL 0.1 mol/L高氯酸、5 mL一級(jí)水淋洗，最后用5 mL氨水-甲醇溶液（5∶95，V/V）洗脫，回集洗脫液于試管中，40 ℃氮吹近干，用甲酸-水（1∶99，V/V）溶液定容1 mL，渦旋混合1 min，過(guò)0.22 μm濾膜后測(cè)定。

1.3.3 儀器條件

色譜條件：HILIC Plus色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；流速0.4 mL/min；流動(dòng)相A為甲酸-水（1∶99，V/V）；流動(dòng)相B為乙腈；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 洗脫條件Table 1 Gradient elution program

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；干燥氣溫度300 ℃；毛細(xì)管電壓3 000 V；噴霧器壓力35 psi；干燥氣流速8 L/min；鞘氣流速11 L/min；鞘氣溫度400 ℃。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 3 種兒茶酚胺類物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters for 3 CAs

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖1 目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Molecule structures of 3 CAs

如圖1所示，3 種化合物均為含氨基的弱堿性化合物，易帶正電荷，在正模式掃描下響應(yīng)值較高，采用選擇離子掃描選定化合物母離子，同時(shí)優(yōu)化毛細(xì)管出口電壓以保證化合物的母離子豐度，選定母離子后再進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量確定3 種化合物的子離子（表2）。

3 種化合物結(jié)構(gòu)相似，都帶有3 個(gè)羥基，均為極性化合物，在非極性色譜柱上保留較弱，為使化合物更好分離和得到良好峰形，本實(shí)驗(yàn)選擇HILIC親水色譜柱進(jìn)行分析，同時(shí)在流動(dòng)相中加入少量甲酸提高樣品的離子化效率，以增大化合物響應(yīng)值，所以本方法選擇乙腈與0.1%甲酸-水（1∶99，V/V）作為流動(dòng)相，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 3 種化合物樣品空白及樣品添加多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖Fig. 2 MRM chromatograms of three CAs in negative and positive samples

2.2 提取溶劑的選擇

3 種兒茶酚胺類化合物均含有羥基和氨基，易溶于水溶液和有機(jī)溶劑，但由于3 種兒茶酚胺類藥物易被氧化，所以在提取溶液中加入適量酸以防止氧化，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比酸化甲醇、酸化乙腈、0.4 mol/L高氯酸溶液、磷酸鹽緩沖溶液（pH 4.0）作提取溶劑，加標(biāo)量為100 μg/kg時(shí)的回回率，如圖3所示。0.4 mol/L高氯酸溶液作提取溶劑時(shí)，3 種兒茶酚胺類均有較高回回率，平均回回率可達(dá)80%以上，故選取0.4 mol/L高氯酸溶液作為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑回收率對(duì)比Fig. 3 Effect of extraction solvents on the recoveries

2.3 提取方式的選擇

圖4 不同提取方式回收率對(duì)比Fig. 4 Effect of extraction methods on the recoveries (n = 3)

肉類由于其脂肪、蛋白含量比較高，某些基質(zhì)會(huì)對(duì)樣品提取的過(guò)程造成影響[37]，因此考察常見(jiàn)4 種提取方式，結(jié)果見(jiàn)圖4。勻漿不僅誤差較小而且提取效率可達(dá)到85%以上，因此選用勻漿為提取方法。

2.4 固相萃取柱的選擇

圖5 不同固相萃取柱回收率對(duì)比Fig. 5 Effect of SPE columns on the recoveries

考察HLB柱、PCX柱、SCX柱、堿性氧化鋁柱對(duì)目標(biāo)化合物的提取、凈化效果，結(jié)果見(jiàn)圖5。固相萃取柱對(duì)于3 種目標(biāo)物質(zhì)的保留都比較穩(wěn)定，PCX柱對(duì)3 種目標(biāo)化合物（添加量40 μg/kg）回回率均高于其他固相萃取柱。

從提取溶劑、提取方式、固相萃取柱的選擇看，3 種化合物之間回回率具有相似的規(guī)律，這可能是由于它們的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相似。腎上腺素在不同的影響因素中回回率最低，可能是其化學(xué)性質(zhì)與另外2 種相比更不穩(wěn)定，更容易被外界（基質(zhì)/環(huán)境）因素干擾。不同提取溶劑和不同固相萃取柱對(duì)3 種化合物內(nèi)回回率的誤差差異較小，不同提取方式對(duì)3 種化合物內(nèi)回回率的誤差差異較大，因此提取方式的選擇對(duì)方法的穩(wěn)定性影響較大。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)是由基質(zhì)中的共提干擾物（非目標(biāo)化合物）與目標(biāo)化合物競(jìng)爭(zhēng)電離所致[38]?；|(zhì)效應(yīng)會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此需要進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)[39]。實(shí)驗(yàn)選取豬肉、牛肉、羊肉進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3，3 種藥物在豬肉、牛肉、羊肉基質(zhì)中都屬于強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，如果用溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，會(huì)造成結(jié)果有偏差，因此需要選擇基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表3 3 種藥物的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)Table 3 Matrix effect evaluation of three CAs

2.6 方法學(xué)結(jié)果

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限測(cè)定結(jié)果

用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，質(zhì)量濃度分別為40、50、100、500、1 000 ng/mL，在選定的前處理和儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，得到不同質(zhì)量濃度的色譜圖，以添加兒茶酚胺類藥物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，兒茶酚胺類藥物峰面積為縱坐標(biāo)，得到3 種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)。利用逐級(jí)稀釋法方空白樣品中添加已知質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3 倍信噪比確定檢出限，10 倍信噪比確定定量限，結(jié)果見(jiàn)表4。該方法在40～1 000 μg/kg范圍內(nèi)3 種兒茶酚胺類物質(zhì)的線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，檢出限為10 μg/kg，定量限為40 μg/kg。

表4 3 種兒茶酚胺類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、線性范圍Table 4 Regression equations, correlation coefficients, LODs, LOQs and linear ranges of three CAs

2.6.2 加標(biāo)回回率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差測(cè)定結(jié)果

分別稱取牛肉、豬肉、羊肉空白樣品各18 份，每份2.0 g，每種空白樣中分別添加40、400、1 000 μg/kg 3 個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平6 個(gè)平行樣品，后按1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)方法制備進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。不同添加水平的3 種兒茶酚胺類物質(zhì)的回回率在75.48%～91.25%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～4.6%，回回率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合日常檢測(cè)的要求。

表5 豬肉、牛肉、羊肉中加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果Table 5 Spiked recoveries for three CAs in different matrix samples(n= 6)

2.7 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性結(jié)果

表6 放置不同時(shí)間3 種藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性Table 6 Storage stability of standard solutions of three CAs

將低、中、高，3 個(gè)質(zhì)量濃度的腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)溶液混標(biāo)放置于室溫（25 ℃）下，比較同一條件下不同放置時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性差異。如表6所示，3 種藥物在室溫放置12 h較穩(wěn)定，放置24 h后腎上腺素開(kāi)始逐漸降解，質(zhì)量濃度降低至原來(lái)的85%，放置36 h后腎上腺素質(zhì)量濃度降低至原來(lái)的80%，去甲腎上腺素和異丙腎上腺素質(zhì)量濃度降低至原來(lái)的90%，所以為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，建議標(biāo)準(zhǔn)溶液臨用現(xiàn)配，同時(shí)樣品提取液需在12 h內(nèi)完成上機(jī)檢測(cè)。

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

采用本方法對(duì)市售的140 件畜肉進(jìn)行測(cè)定，種類包括牛肉、羊肉、豬肉，1 件豬肉樣品檢出腎上腺素，含量為50 μg/kg。同時(shí)對(duì)該樣品進(jìn)行水分測(cè)定，結(jié)果大于77%，不符合GB 18394—2001《畜禽肉水分限量》的要求，表明兒茶酚胺類物質(zhì)對(duì)水分是否超標(biāo)具有一定的指示作用。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取技術(shù)與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定畜肉中腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素3 種兒茶酚胺類藥物，方法簡(jiǎn)便、快速。方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確、可靠，為考察注水肉的關(guān)鍵指標(biāo)提供思路，為監(jiān)管部門(mén)打擊違法行為提供手段。同時(shí)方法還存在一些不足，對(duì)于同種影響因素內(nèi)部誤差產(chǎn)生的差異以及不同化合物間回回率差異的原因仍需進(jìn)行大量研究工作。兒茶酚胺類化合物大部分是生物體內(nèi)正常代謝產(chǎn)生的物質(zhì)，因此如何判定外源性注射兒茶酚胺仍需進(jìn)一步研究。