5 株乳酸菌吸附丙烯酰胺穩(wěn)定性的比較

趙思佳，李 蕊，劉 彤，孫洪洋，沈 玉，趙筱鐸，商佳琦，邵美麗,2,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

日常飲食中，由于生冷食材的貯藏、加工、或者烹飪方式不當(dāng)會產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，丙烯酰胺（acrylamide，AA）在食品熱加工過程中由天冬酰胺和葡萄糖經(jīng)美拉德反應(yīng)形成[1-2]。研究證實AA會對人體和動物產(chǎn)生神經(jīng)毒性、遺傳毒性、生殖毒性和致癌性，給健康造成極大隱患[3-6]，已被國際癌癥研究機構(gòu)劃分為2A組致癌物質(zhì)。因此，人們利用各種物理、化學(xué)、生物等方法減少AA含量，或降低其在食品中所帶來的負(fù)面影響[7-10]。然而，物理和化學(xué)方法具有一定的局限性，例如：某些營養(yǎng)成分可能會喪失，或影響到食品的發(fā)全性，或必須用到昂貴的設(shè)備[11]。因此，近年來，專家學(xué)者對利用生物方法降低有害物質(zhì)毒性進行了重點探究。

乳酸菌作為生物吸附方法的常用工具不僅應(yīng)用范圍廣，而且兼具發(fā)全高效、生理功能多樣性等明顯優(yōu)勢。已證實乳酸菌對多種有害物質(zhì)具有良好的吸附能力。例如嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌對黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素G1具有較好的吸附能力[11-12]；Corassin等[13]發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌、德氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌對黃曲霉毒素M1的吸附率均在11%左右；Abbès等[14]利用副干酪乳桿菌對伏馬菌素B1進行去除，也取得良好效果；Wang Ling等[15]通過實驗證實6 株乳酸菌對棒曲霉毒素具有清除效果；并且一些乳酸菌對許多重金屬[16-18]及其他有害物質(zhì)[19]也具有較好的吸附作用[20]。

目前有關(guān)乳酸菌吸附AA的研究很少。Serrano-Ni?o等[21]認(rèn)為乳酸菌細(xì)胞表面可以與AA單體結(jié)合形成比較牢固的網(wǎng)狀基質(zhì)。Shen Yu等[22]發(fā)現(xiàn)乳酸菌細(xì)胞比表面積和細(xì)胞壁的粗糙程度與其吸附能力密切相關(guān)，細(xì)胞比表面積大的乳酸菌具有更好的吸附能力，并且AA的吸附率與細(xì)胞壁粗糙程度呈正比，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)主要由肽聚糖和表面蛋白構(gòu)成，二者共同影響細(xì)胞壁表面粗糙程度。肽聚糖中的3 種官能團（C—O、C＝O、N—H）被認(rèn)為是細(xì)胞壁“高度多孔”的主要因素，增加了細(xì)胞壁粗糙程度，從而增強了對AA的吸附能力。Zhang Dan等[23]發(fā)現(xiàn)肽聚糖的完整性越高，乳酸菌對AA的吸附率越高，并且肽聚糖中的4 種氨基酸（丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸）總含量與AA吸附率呈正比，同時4 種氨基酸中丙氨酸含量對AA吸附率的影響較為明顯。

盡管少數(shù)實驗證實了乳酸菌可以有效吸附AA，并對其吸附機制有了一定的認(rèn)識，但沒有對乳酸菌的吸附穩(wěn)定性進行深入研究。而乳酸菌與AA形成的乳酸菌-丙烯酰胺復(fù)合物（lactic acid bacteria-acrylamide，LAB-AA）在體內(nèi)外環(huán)境下能否穩(wěn)定存在則是抑制AA毒性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，本實驗選擇5 株乳酸菌作為研究對象，以AA釋放率為考察指標(biāo)，比較5 株乳酸菌與AA形成的復(fù)合物在無菌去離子水、不同有機溶劑（甲醇、乙腈-水、丙酮）及體外模擬胃、腸道環(huán)境下的穩(wěn)定性，同時比較5 株乳酸菌滅活前后與AA形成復(fù)合物的穩(wěn)定性差異，以期為AA毒性抑制的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

植物乳桿菌ATCC8014（Lactobacillus plantarum ATCC8014）、植物乳桿菌1.0665（L. plantarum 1.0665）、植物乳桿菌806（L. plantarum 806）、干酪乳桿菌ATCC393（L. casei ATCC393）、嗜酸乳桿菌 KLDS 1.0307（L. acidophilus KLDS 1.0307）均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院菌種庫保存。

1.1.2 試劑

AA標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%） 美國Amresco公司；甲醇（色譜純） 廣州市健碩科技有限公司；丙酮、乙腈（色譜純） 哈爾濱市志飛生物技術(shù)公司；胃蛋白酶、濃硝酸、濃鹽酸、膽鹽、胰蛋白酶 遼寧博雅生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基 常州蘭華試驗試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司；GL-21M高速冷凍離心機、HVE-50高壓滅菌鍋 浙江德育制造有限公司；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 江蘇中坤儀器廠；DK-98-II恒溫水浴鍋 遼寧大成試驗分析儀器廠；DB-3B電子分析天平 深圳物生生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化及菌懸液配制

將實驗用的5 株乳酸菌接種在MRS培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)24 h，并連續(xù)活化2 次，培養(yǎng)時間為8～12 h。再將乳酸菌以3%的接種量于MRS培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜，8 000×g、4 ℃離心5 min回集沉淀，并用無菌去離子水洗滌2 次，然后將其懸浮在50 mL無菌去離子水中，得到活菌菌懸液。最后，選取一半懸浮液在121 ℃滅活15 min[23]，得到高壓滅活菌的細(xì)菌懸浮液。2 種懸浮液分別用于后續(xù)實驗。

1.3.2 AA結(jié)合實驗

分別在900 μL活菌和滅活組菌懸液中加入100 μL AA（6 μg/mL）溶液，37 ℃培養(yǎng)6 h。8 000×g、4 ℃離心5 min回集上清液，備用。

1.3.3 高效液相色譜法測定乳酸菌對AA吸附率

采用高效液相色譜法，色譜柱為Alltima Inertsil ODSP-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），以5%甲醇溶液為流動相，紫外線檢測器參數(shù)設(shè)置為205 nm，流速為1 mL/min，注射體積為20 μL。測定所回回上清液中AA含量[23]。以沒有添加菌懸液的AA工作液作為空白對照。乳酸菌對AA的吸附率按式（1）計算：

式中：A0為空白樣液中AA含量；A為加入AA的菌懸液經(jīng)離心回集的上清液中AA含量。

1.3.4 LAB-AA復(fù)合物的體外穩(wěn)定性分析

為測定LAB-AA復(fù)合物的穩(wěn)定性，將其分別置于無菌去離子水、甲醇、丙酮、乙腈-水（2∶1，V/V）中連續(xù)洗滌3 次，8 000×g、4 ℃離心5 min，回集上清液，用高效液相色譜法測定AA釋放率。AA釋放率按式（2）計算：

式中：B為不同洗脫液中AA含量；A0為空白樣液中AA含量；A為加入乳酸菌菌懸液和AA反應(yīng)后離心回集的上清液中AA含量。

1.3.5 LAB-AA復(fù)合物的體內(nèi)穩(wěn)定性分析

1.3.5.1 人工模擬胃環(huán)境

將10%的鹽酸溶液加入無菌去離子水中，再加入胃蛋白酶，完全溶解后，得到pH值分別為1.5、2.5、3.5的人工胃液，通過0.22 μm濾膜除菌。將活菌和高壓滅活菌的AA復(fù)合物分別懸浮在人工胃液中，在37 ℃培養(yǎng)1、2、3 h。然后，將懸浮液8 000×g、4 ℃離心5 min，回集上清液，用高效液相色譜法測定AA釋放量，并計算釋放率。

1.3.5.2 人工模擬腸道環(huán)境

將活菌和高壓滅活菌的AA復(fù)合物分別懸浮于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的膽鹽溶液（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）和10 mg/mL的胰蛋白酶溶液，并調(diào)節(jié)pH值為6.8。在37 ℃培養(yǎng)3、4、5、6 h，8 000×g、4 ℃離心5 min，回集上清液，用高效液相色譜法測定AA釋放量，并計算釋放率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3 次，所有結(jié)果表示為 ±s。數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，采用Origin pro 8.6進行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌對AA吸附能力的比較

由圖1可知，當(dāng)乳酸菌暴露于AA環(huán)境中時，5 株高壓滅活菌株均表現(xiàn)出比活菌更高的AA吸附率。其中，植物乳桿菌ATCC8014的高壓滅活組和活菌組對AA的結(jié)合能力最高，吸附率分別為96.53%和93.16%，而嗜酸乳桿菌KLDS1.0307的高壓滅活組和活菌組對AA的結(jié)合能力最低。這一實驗結(jié)果與El-Nezami[24]和Piotrowska[25]等的研究成果相似。Piotrowska等[25]發(fā)現(xiàn)了3 種熱滅活乳酸菌的赭曲霉毒素A吸附能力高于活性菌，并提出經(jīng)高壓滅活后細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并且通過細(xì)胞壁的疏水性，和電子供體-受體相互作用來促進與赭曲霉毒素A的結(jié)合。由此可推測，AA與乳酸菌細(xì)胞壁結(jié)合，且主要與乳酸菌肽聚糖和磷壁酸有關(guān)，而高溫處理會影響乳酸菌細(xì)胞壁雙層膜結(jié)構(gòu)，并且肽聚糖的交聯(lián)被打破，從而導(dǎo)致孔徑增加。因此毒素除與細(xì)胞壁結(jié)合外，甚至還可以與細(xì)胞壁內(nèi)的原生質(zhì)膜結(jié)合，增加了乳酸菌與AA的結(jié)合位點。由此可見，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變對高壓滅活乳酸菌吸附能力起到關(guān)鍵作用。

圖1 5 株乳酸菌對AA的吸附率Fig. 1 AA adsorption percentages of the five strains of LAB

由圖1可知，無論活菌還是高壓滅活菌，5 株乳酸菌之間吸附率差異性顯著（P＜0.05）。Wang Ling等[15]發(fā)現(xiàn)不同乳酸菌與棒曲霉結(jié)合率不同，其原因是部分棒曲霉進入乳酸菌肽聚糖層，而不同品種乳酸菌肽聚糖具有不同官能團，導(dǎo)致肽聚糖的疏松程度不同。Zhang Dan等[23]認(rèn)為，肽聚糖含量的差異也會導(dǎo)致不同菌種的吸附力差異。因此，推測5 株乳酸菌對AA吸附率差異是各自肽聚糖結(jié)構(gòu)及含量不同導(dǎo)致的。

2.2 LAB-AA復(fù)合物的體外穩(wěn)定性

表1 LAB-AA復(fù)合物經(jīng)有機溶劑洗脫的AA釋放率Table 1 Stabilities of the LAB-AA complexes when exposed to organic solvents in vitro

如表1所示，LAB-AA復(fù)合物經(jīng)有機溶劑的3 次洗滌，均沒有AA釋放，說明乳酸菌和AA的結(jié)合非常穩(wěn)定。參考Serrano-Ni?o等[21]的結(jié)論可推測，AA單體結(jié)合與乳酸菌細(xì)胞表面形成比較牢固的網(wǎng)狀基質(zhì)，因此，LAB-AA復(fù)合物具有良好的穩(wěn)定性。

表2 LAB-AA復(fù)合物經(jīng)無菌去離子水洗脫的AA釋放率Table 2 Stabilities of the LAB-AA complexes when exposed to aseptic deionized water in vitro%

如表2所示，5 株乳酸菌經(jīng)無菌去離子水第1次洗滌后均有不同程度的釋放，并且高壓滅活菌的釋放率均低于相對應(yīng)的活菌組。而經(jīng)無菌去離子水第2次和第3次洗滌后，5 株高壓滅活菌和活菌的AA復(fù)合物對AA均不再釋放。且高壓滅活菌株的AA復(fù)合物對AA的釋放率范圍為3.59%～35.22%，明顯低于活菌的復(fù)合物對AA的釋放率7.34%～53.56%。有研究表明，疏水相互作用在乳酸菌與毒素相結(jié)合過程中起到了重要作用[26]。因此可推測，本實驗中復(fù)合物水洗液中有少量AA的釋放，是水對AA與乳酸菌之間的疏水作用產(chǎn)生影響而造成的，從而影響LAB-AA復(fù)合物穩(wěn)定性。

2.3 LAB-AA復(fù)合物的體內(nèi)穩(wěn)定性

2.3.1 人工模擬胃環(huán)境

表3 pH值對LAB-AA復(fù)合物AA釋放率的影響Table 3 Effect of pH on the stability of the LAB-AA complexes%

由表3可以明顯看出，pH值與作用時間都會對LABAA復(fù)合物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。無論是高壓滅活組還是活菌組，植物乳桿菌ATCC8014的AA復(fù)合物在pH值為1.5、2.5的人工胃液中分別作用1、2 h后，均無AA釋放，說明在此條件下，該復(fù)合物是最穩(wěn)定的；同時，AA釋放量隨著作用時間的延長而增加，當(dāng)作用時間為3 h時，植物乳桿菌ATCC8014的高壓滅活組復(fù)合物的AA釋放率最低。綜上所述，植物乳桿菌ATCC8014的AA復(fù)合物在模擬胃環(huán)境中穩(wěn)定性最佳。El-Nezami等[24]認(rèn)為，pH值對乳酸菌吸附黃曲霉毒素B1的穩(wěn)定性有影響，相同條件下pH值低則復(fù)合物穩(wěn)定性強，這與本實驗結(jié)果一致：在模擬胃環(huán)境實驗中，LAB-AA復(fù)合物的穩(wěn)定性受pH值的影響很大，并隨時間而變化。相關(guān)研究表明，pH值和作用時間對細(xì)菌活力有顯著影響，且據(jù)推測，酸處理會降解乳酸菌細(xì)胞壁肽聚糖的多糖結(jié)構(gòu)，從而暴露更多結(jié)合位點，使乳酸菌與AA結(jié)合更加穩(wěn)定[27]。因此，本實驗認(rèn)為不同pH值改變了乳酸菌自身活力及其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而影響了復(fù)合物的穩(wěn)定性。

2.3.2 人工模擬腸環(huán)境

2.3.2.1 膽鹽對復(fù)合物穩(wěn)定性影響

表4 膽鹽對LAB-AA復(fù)合物AA釋放率的影響Table 4 Effect of bile salt on the stability of the LAB-AA complexes%

由表4可知，在膽鹽環(huán)境中，5 株LAB-AA復(fù)合物均能釋放AA，但高壓滅活菌組的LAB-AA復(fù)合物的釋放率明顯低于活菌復(fù)合物的釋放率。同時，LAB-AA復(fù)合物的穩(wěn)定性受時間和膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，從整體趨勢看，作用時間越長AA釋放率越高。其中，植物乳桿菌ATCC8014的高壓滅活菌組在0.4%膽鹽條件下3 h內(nèi)穩(wěn)定性最佳，AA釋放率僅為5.17%。先前研究發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽能迅速溶解膜脂類并引起膜蛋白的解離，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的膽鹽可通過對膜通透性和流動性的影響，從而破壞膜的完整性，并且影響細(xì)胞表面的疏水性和電位等物理化學(xué)性質(zhì)[28-30]。因此，膽鹽的這種破壞作用可能影響乳酸菌的蛋白質(zhì)及膜的結(jié)構(gòu)，從而影響LAB-AA復(fù)合物的穩(wěn)定性。

2.3.2.2 胰蛋白酶對復(fù)合物穩(wěn)定性影響

表5 胰蛋白酶對復(fù)合物AA釋放率的影響Table 5 Effect of trypsin on the stability of the LAB-AA complexes%

由表5可知，在胰蛋白酶環(huán)境中，5 株乳酸菌的AA復(fù)合物均有AA釋放，且作用時間對復(fù)合物的AA釋放率影響不大。同樣，高壓滅活組的菌株復(fù)合物的穩(wěn)定性明顯強于活菌組，并且，植物乳桿菌ATCC8014復(fù)合物的AA釋放率明顯低于另外4 株乳酸菌復(fù)合物，3 h釋放率最低為6.63%，說明其高壓滅活組的復(fù)合物在胰蛋白酶環(huán)境中穩(wěn)定性最佳。

Serrano-Ni?o等[21]研究發(fā)現(xiàn)丙氨酸是乳酸菌與黃曲霉毒素和AA結(jié)合的重要位點。Zhang Dan等[23]也得出相同結(jié)論，不僅丙氨酸是乳酸菌和AA的重要結(jié)合位點，賴氨酸也在乳酸菌吸附AA的過程中起到關(guān)鍵作用。同時，本實驗發(fā)現(xiàn)5 株LAB-AA復(fù)合物的穩(wěn)定性受胰蛋白酶的影響，胰蛋白酶可能正是通過作用在賴氨酸的結(jié)合位點，破壞乳酸菌和AA的結(jié)合，從而對LAB-AA復(fù)合物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。這一發(fā)現(xiàn)可能對乳酸菌在小腸暴露具有潛在的生物學(xué)意義，表明LAB-AA復(fù)合物可能在腸道內(nèi)具有穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

本實驗中的5 株乳酸菌株均能有效吸附AA，且高壓滅活菌株吸附AA的能力優(yōu)于其活菌株。其中植物乳桿菌ATCC8014吸附能力最強，其高壓滅活菌組和活菌組的AA吸附率分別為96.53%和93.16%。5 株乳酸菌與AA形成的復(fù)合物在甲醇、丙酮、乙腈-水中均可穩(wěn)定存在。盡管在第1次無菌去離子水洗滌后，LAB-AA復(fù)合物釋放出少量的AA，但第2、3次水洗均無AA釋放，這說明LAB-AA復(fù)合物在無菌去離子水中也呈現(xiàn)較為穩(wěn)定的狀態(tài)。此外，通過體外胃腸道模擬實驗發(fā)現(xiàn)，LAB-AA復(fù)合物穩(wěn)定性與pH值、膽鹽及作用時間有關(guān)，但在胰蛋白酶環(huán)境中LAB-AA復(fù)合物穩(wěn)定性稍有減弱，且與作用時間無關(guān)。整體看，植物乳桿菌ATCC8014在上述環(huán)境中不僅對AA具有最強的吸附能力，而且其復(fù)合物也具有非常好的穩(wěn)定性。本實驗為進一步探究乳酸菌吸附AA的可行性及降低食品中AA對機體危害提供了理論支持。