秦嶺綠茶茶多酚抑菌活性及其機理研究

陳 琛，徐尤美，藺蓓蓓，景 嫻，劉 祥，付 靜，江 海，鄭紅星

（陜西理工大學中德天然產(chǎn)物研究所/陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723000）

茶多酚是從茶葉中提取的一類多酚混合物，是茶葉中的主要品質(zhì)成分，最高占茶葉干重的30%[1]。茶多酚中的兒茶素類含量約占茶多酚總量的60%～80%，主要包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechingallate，EGCG），表兒茶素沒食子酸酯（epicatechingallate，ECG），表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC），表兒茶素（epicatechin，EC），兒茶素（catechin，C）等[2]。茶多酚具有多種生物活性和功能，如抗氧化[3]、抗癌[4-5]、抗菌抗炎[6]、預防糖尿病[7]、阿爾茨海默病[8]、肝纖維化[9]、肥胖[10]等。茶多酚具有抗氧化、抗菌、抗輻射等多種生物功能及保健功效，在醫(yī)藥、食品保鮮防腐、動物飼料添加劑等方面展示了廣闊的應用前景。茶多酚的提取方法包括[11]：熱水提取法、有機溶劑提取法、超臨界提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、化學試劑提取法，其中熱水提取法比較常用。目前國內(nèi)外對于茶多酚的研究主要是茶多酚的藥理作用、食品保鮮等，在茶多酚的抑菌方面主要開展了對植物病源真菌、稻瘟病菌等的抑菌活性研究，對臨床致病病原菌的抑菌作用研究較少。

秦嶺綠茶常以清明前后的嫩芽制成“清明茶”出售，而夏秋粗老茶的綜合開發(fā)利用滯后，造成大量的夏秋粗老茶葉的浪費。本研究主要開展了秦嶺綠茶茶多酚的提取工藝、兒茶素分析檢測及提取物對標準菌株、臨床致病菌的抑菌活性研究，并探索了其抑菌機理，為秦嶺綠茶，特別是夏秋粗老茶的綜合開發(fā)利用及臨床應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料

綠茶來自西鄉(xiāng)縣，茶葉品種為西鄉(xiāng)大腳板，采集時間為5 月上旬，鮮葉采摘一芽三葉。

1.1.2 供試菌株

標準菌株：金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC 25923、枯草芽孢桿菌BacillussubtilisATCC 6633、大腸桿菌EscherichiacoliATCC 25922、大腸桿菌EscherichiacoliATCC 8739、傷寒沙門氏菌BacteriumtyphosumATCC 14028、白色念珠菌Candida albicansATCC 10231。

臨床分離株：枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus、諾卡氏菌Nocardiaceae、糞腸球菌Enterococcusfaecalis、大腸桿菌Escherichia coli08040726、肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae08031012、嗜麥芽假單胞菌Stenotrophomonas maltophilia、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa、白色念珠菌Candidaalbicans08022710、白色念珠菌CandidaalbicansIS、光滑念珠菌Candidaglabrata08A802，以上菌株由大連理工大學于海寧教授提供。

1.1.3 主要試劑

兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）5 種標準品（上海同田生物科技公司）；乙腈、甲酸（Fisher Scientific 公司）；LX-17 樹脂（西安藍曉科技新材料股份有限公司）；考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒（普利萊基因技術(shù)有限公司）；堿性磷酸酶試劑盒（北京雷根生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 儀器

Waters Acquity-UPLC（美國Waters 公司）；數(shù)控超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）；微波提取儀（南京杰全微波設備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RV10 基本型（德國IKA 公司）；722G 可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.2.2 茶多酚的提取純化

茶多酚的提取分為3種方法，水浴提取參考A.Bharadwaz 等[12]的方法。超聲輔助提取參考朱德文等[13]的方法，略有改動。微波輔助提取參考Li D.C.等[14]的方法，略有改動。以上3種方法提取的茶多酚粗提液分別進一步用大孔吸附樹脂LX-17 純化。茶多酚含量測定采用標準“GB/T 31740.2—2015，茶制品第2 部分”進行[15]，測定茶多酚含量，并計算其得率，按下式計算：

1.2.3 茶多酚中兒茶素的含量的測定

利用本實驗室前期建立的UPLC 法[16]測定茶多酚中兒茶素含量。

1.2.4 茶多酚抑菌活性的研究

①抑菌活性測定樣品制備。精確稱取400 mg 茶多酚溶于10 mL 蒸餾水中，振蕩搖勻；取1 mL 對倍稀釋，配置成20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL 等濃度，用0.22 μm 濾膜過濾，備用。

②薄層瓊脂糖孔穴擴散法。采用薄層瓊脂糖孔穴擴散法[17-18]，有抑菌圈的進一步采用肉湯稀釋法定量測定最小抑菌濃度。

③常量肉湯稀釋法。MIC 的測定采用常量肉湯稀釋法并加以改進[19-20]。

1.2.5 茶多酚抑菌機理的研究

①茶多酚對細菌細胞膜通透性的影響。向培養(yǎng)到對數(shù)期的B.subtilisATCC 6633 菌液中加入茶多酚，使培養(yǎng)液中茶多酚終濃度為0.1 mg/mL，培養(yǎng)8 h，每隔2 h 取菌懸液5 mL，離心后測電導率，對照以無菌水替代茶多酚[21]。

②培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量測定。取培養(yǎng)對數(shù)期的B.subtilisATCC 6633 菌液，加入茶多酚使其最終濃度為0.3%，每隔1 h 取樣，然后采用考馬斯亮藍法試劑盒測定細菌培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量，對照用蒸餾水代替茶多酚。

③培養(yǎng)液中堿性磷酸酶活性測定。將3 倍最低抑菌濃度的茶多酚溶液與B.subtilisATCC 6633 菌液等體積混合，37 ℃搖床培養(yǎng)8 h，每隔1 h 取樣，離心取上清液，用堿性磷酸酶試劑盒測定。對照組以蒸餾水代替茶多酚。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗做3 次重復，數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS 軟件進行分析處理作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 秦嶺綠茶茶多酚提取純化及檢測

采用水浴提取、超聲輔助提取、微波輔助提取秦嶺綠茶茶多酚，分別進一步用大孔吸附樹脂LX-17 純化，測定茶多酚的含量，計算提取率，3種方法提純的茶多酚得率見表1。

表1 不同提取方法的茶多酚得率Table 1 The yield of different extraction method on green tea polyphenols

通過上表可以看出，秦嶺綠茶通過不同的提取方法，茶多酚得率有較大的差異，得率大小順序為微波輔助法＞超聲輔助法＞水浴提取法。

3種不同方法提純的秦嶺綠茶茶多酚中5 種兒茶素的含量是通過超高效液相色譜法測定，測定結(jié)果見表2。秦嶺綠茶中5 種兒茶素組分由高到低依次是：表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）＞兒茶素（C）＞表兒茶素沒食子酸酯（ECG）＞表兒茶素（EC）＞表沒食子兒茶素（EGC）。超聲輔助法得到的兒茶素的含量最高，為（579.2±2.4）mg/g，微波輔助提取法得到的兒茶素的含量為（568.1±2.3）mg/g。

2.2 抑菌活性

2.2.1 薄層瓊脂糖孔穴擴散法

薄層平板瓊脂糖孔穴擴散法測定了茶多酚的抑菌圈大小見表3。從表3 中可以看出秦嶺綠茶茶多酚具有廣譜抑菌活性，對革蘭氏陰性菌（G-）大腸埃希菌、傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜麥芽假單胞菌、綠膿桿菌和革蘭氏陽性菌（G+）金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、諾卡氏菌、糞腸球菌、真菌白色念珠菌和光滑念珠菌均有明顯抑菌作用。對G+菌B.subtilisATCC 6633 的抑菌圈最大，為（18.4±0.36）mm。

表2 秦嶺綠茶兒茶素含量測定Table 2 Content of the individual components in polyphenols

圖1 UPLC 分析微波提取法提純的秦嶺綠茶兒茶素含量Figure 1 The chromatogram of tea polyphenols components of UPLC for micro-assisted extraction method

2.2.2 最小抑菌濃度

以常量肉湯稀釋法測定了微波提取法提純的秦嶺綠茶茶多酚對16 株菌的最小抑菌濃度，結(jié)果如表4 所示。從表中可以看出，MIC 范圍是0.0625～2 mg/mL，抑菌效果最好的是B.subtilisATCC 6633和C.glabrataMIC 為0.0625 mg/mL，對肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果最弱，MIC 為2 mg/mL。

2.3 茶多酚抑菌機理

2.3.1 對細菌細胞膜通透性的影響

細胞外膜是細菌的保護屏障，當細菌遇到抗菌物質(zhì)時細胞膜會被破壞，細菌的保護屏障被打破，細胞內(nèi)的K+、Na+等小分子物質(zhì)就會外泄，進而使細菌培養(yǎng)液的電導率上升，因此細菌培養(yǎng)液電導率的變化能夠反映細菌細胞膜通透性的變化。

以抑菌活性最好的B.subtilisATCC 6633 為作用菌株，結(jié)果顯示（見圖2），茶多酚能影響枯草芽孢桿菌的電導率，60 min 內(nèi)茶多酚處理組和對照組電導率變化不明顯，但是當60 min 后，并隨著作用時間的延長，茶多酚對細胞膜逐漸產(chǎn)生破壞作用，致使B.subtilisATCC 6633 菌液的電導率逐漸上升，說明茶多酚可改變大枯草芽孢桿菌細胞膜的通透性，使細胞內(nèi)的物質(zhì)發(fā)生外漏。

表3 茶多酚的抑菌活性Table 3 Antimicrobial activity of green tea polyphenols

表4 茶多酚最小抑菌濃度Table 4 Minimum inhibitory concentration (MIC) of green tea polyphenols

2.3.2 細菌培養(yǎng)液中蛋白濃度的測定

正常情況下細菌細胞壁的微孔僅容許小于1 nm的分子通過，大分子蛋白不能透過細胞壁，當細胞壁通透性發(fā)生改變，一些大分子蛋白質(zhì)也能透過細胞壁分泌到胞外[22]。培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果（見圖3）表明秦嶺綠茶茶多酚對B.subtilisATCC 6633 細胞膜滲漏具有顯著的影響，添加茶多酚后6 h的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液中蛋白濃度為310 μg/mL，而未加茶多酚處理的對照組，其培養(yǎng)液中蛋白濃度非常低，僅為34 μg/mL，添加秦嶺綠茶茶多酚的培養(yǎng)液組蛋白濃度遠高于對照組，茶多酚組與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。

2.3.3 培養(yǎng)液中堿性磷酸酶活性測定

通常情況下在胞外檢測不到堿性磷酸酶的活性，一旦細胞壁或細胞膜遭到破壞后，菌體細胞的細胞壁通透性增加，堿性磷酸酶會釋放到細胞外，通過測定細胞外堿性磷酸酶活性的變化便可反映細胞壁的透性變化。試驗結(jié)果（見圖4）表明當作用6 h 時，測定了茶多酚組和對照組培養(yǎng)液中堿性磷酸酶活性，茶多酚組與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。

圖4 茶多酚作用B.subtilis ATCC 6633 細菌培養(yǎng)液中堿性磷酸酶活性Figure 4 Effect of tea polyphenols on extracellular AKP content of B.subtilis ATCC 6633 culture medium

3 討論與結(jié)論

本研究中秦嶺綠茶通過不同的提取方法，茶多酚得率有較大的差異，得率順序大小為微波輔助法＞超聲輔助法＞水浴提取法。江慎華等[23]報道采用水浴振蕩提取、微波輔助提取、超聲輔助提取和超聲-微波協(xié)同提取丁香總多酚、總黃酮的得率結(jié)果與本研究結(jié)果一致，得率高低依次為：微波輔助法＞超聲輔助法＞水浴振蕩法。周勇等[24]研究荷葉活性物質(zhì)提取的研究中得到微波輔助法要優(yōu)于超聲輔助法的結(jié)論。本研究中通過UPLC 測定了3種不同提取方法提取所得茶多酚中兒茶素的含量，超聲輔助法得到的兒茶素的含量最高，達到了（579.2±2.4）mg/g，微波輔助提取法得到的兒茶素的含量達到了（568.1±2.3）mg/g。Xi J.等[25]報道通過HPLC 測定了不同提取方法提取的杭州綠茶中5 種兒茶素，其中通過超聲提取法兒茶素的含量為（486±5.42）mg/g，微波提取法兒茶素的含量為（398±6.42）mg/g，兩種方法提取的兒茶素含量均低于本研究所得的秦嶺綠茶中兒茶素的含量。

通常情況下，茶多酚對G+菌的抑制作用比對G-菌的抑制作用強，Y.Yoda 等[26]比較EGCG 對G+菌的葡萄球菌屬和G-菌的敏感性的研究結(jié)果顯示，EGCG 對葡萄球菌的MIC 為0.050～0.1 mg/mL，而對G-菌的MIC≥0.8 mg/mL。A.Araghizadeh 等[27]的研究了綠茶提取物對齲齒和牙周來源的臨床分離株的抑菌活性，也發(fā)現(xiàn)茶多酚對G+菌的抑制作用明顯高于對G-的抑制作用。本研究的結(jié)果也與以上兩個研究小組的結(jié)果相似，秦嶺綠茶茶多酚對6 株G+菌的平均MIC=0.198 mg/mL，對7 株G-菌的平均MIC=0.929 mg/mL，說明秦嶺綠茶茶多酚對G+菌的抑菌作用優(yōu)于G-菌。究其主要原因是茶多酚能特異性地凝固細菌蛋白、破壞細菌細胞膜結(jié)構(gòu)，與細菌遺傳物質(zhì)DNA 結(jié)合，從而改變細菌生理抑制生長。

茶多酚對真菌具有顯著的抑制效果，D.María等[28]研究了發(fā)現(xiàn)單體EGCG 對標準菌株C.albicansATCC 10231 和12 株臨床分離真菌菌株的抑菌活性，EGCG 對C.albicansATCC 10231 的MIC 為0.004 mg/mL，對臨床分離株的MIC 為0.001～0.032 mg/mL，而本研究秦嶺綠茶茶多酚對C.albicansATCC 10231的MIC 為0.125 mg/mL，分析原因可能是本研究中所用的茶多酚是粗提物（茶多酚混合物），混合物的抑菌活性沒有茶多酚單體的抑菌活性高，純化的茶多酚單體抑菌活性要高于粗提物的抑菌活性，且茶多酚的4 種主要兒茶素抑菌活性強弱順序為EGCG＞ECG＞EGC＞EC。M.Hirasawa 等[29]研究了茶多酚對14株抑制白色念珠菌的活性，MIC 范圍是0.062 5～0.25 mg/mL，且認為茶多酚抑制白色念珠菌的活性與pH 值有關(guān)，在pH 值為7.0 抑制活性最好。

以秦嶺綠茶為原材料，采用水浴、超聲輔助、微波輔助3種方法提取茶多酚，大孔樹脂LX-17 純化。秦嶺綠茶茶多酚對16 株菌株均有抑菌作用。經(jīng)茶多酚處理后細菌培養(yǎng)液的電導率、蛋白濃度和堿性磷酸酶活性均增大，由此說明了茶多酚可以破壞細胞膜的完整性，導致細胞通透性增加，致使細胞內(nèi)容物泄露到胞外，初步闡明茶多酚的抑菌機理。